فحص المواد الغذائية للفئة 1 Integrons وجين كاسيتات
Summary
This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.
Abstract
Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.
Introduction
كان اكتشاف المضادات الحيوية واحدة من أعظم الإنجازات العلمية في القرن التاسع 20. ومع ذلك، فقد أدى استخدام وإساءة استخدام المضادات الحيوية لتطور السريع للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية، وهذه تشكل الآن تهديدا خطيرا للصحة العامة في القرن الحادي و21. صعود سلالات بكتيرية مقاومة لمعظم خيارات العلاج يزيد من احتمال أننا ندخل عصر حيث العقاقير المضادة للميكروبات لم تعد فعالة 1،2.
الآلية الوراثية التي تمنح المقاومة للمضادات الحيوية هو نظام القديم، سبقت البشر والضغوط اختيار المضادات الحيوية من قبل الملايين من 3 سنوات. العناصر الجينية المحمولة، مثل البلازميدات والترانسبوزونات والجزر الجينومية والعناصر وintegrons اقترانية التكاملية يمكن نشر الجينات المقاومة للمضادات الحيوية (ARG) داخل وبين الأنواع البكتيرية 4 على حد سواء. من هذه، وقد لعبت integrons دورا مركزيا في انتشار ARG، على الرغم منحقيقة أنها تعتمد على البلازميدات والترانسبوزونات للتعبئة والإدراج في الجينوم البكتيري 5. Integrons التقاط أشرطة الجينات باستخدام integron-integrase، ومن ثم التعبير عن أشرطة باستخدام integron المشفرة المروج 6،7 (الشكل 1). Integron الجينات أشرطة عناصر المحمولة الصغيرة التي تتكون من واحد إطارات القراءة المفتوحة (ORF) الذي المنتجات يمكن أن تضفي مقاومة للمضادات الحيوية أو المطهرات 8. الفئة 1 integrons هي integrons تعافى الأكثر شيوعا من العزلات السريرية 5، حيث اكتسبت مجتمعة أكثر من 130 مختلفة أشرطة المقاومة للمضادات الحيوية الجينات 9.
انتشار الطبقة 1 integrons إلى المتعايشة والمسببة للأمراض البكتيريا المرتبطة الإنسان يولد تيارات النفايات البشرية التي تحتوي على أعداد كبيرة من هذه العناصر الجينية 10. يتم الافراج يقدر ب 10 19 البكتيريا التي تحتوي على الطبقة 1 integrons عن طريق مياه الصرف الصحي الحمأة كل ط العامن المملكة المتحدة (11). ولذلك ليس من المستغرب أن الطبقة 1 integrons يمنح المقاومة للمضادات الحيوية يجري حاليا الكشف عن الجراثيم في الطيور البرية والأسماك، وغيرها من 12-14 الحياة البرية الوطنية. الإفراج عن integrons مرة أخرى إلى البيئة يشكل خطرا كبيرا على الصحة العامة، منذ اقتناء أشرطة الجينات الجديدة وإعادة ترتيب معقدة مع عناصر المحمولة الأخرى مازالت تحدث، وخاصة في محطات معالجة مياه الصرف الصحي وغيرها من المسطحات المائية 15-18. البيئة الطبيعية ثم يصبح أرضا خصبة لتجنيد محددات مقاومة جديدة ومسببات الأمراض الانتهازية 19،20. يمكن للبكتيريا التي تحتوي على integron جديدة وسائط جديدة دائرة حول العودة الى المجتمع البشري من خلال المياه والأغذية الملوثة 21،22. مراقبة وسائط البيئية هي استراتيجية رئيسية لفهم وإدارة المقاومة للمضادات الحيوية في 23 في المستقبل. على وجه الخصوص، ينبغي إيلاء الانتباه إلى المواد الغذائية التي تؤكل نيئة أوالمطبوخة قليلا، لأن هذه تمثل أكبر تهديد لنقل عناصر متنقلة جديدة ومسببات الأمراض.
في هذا البروتوكول، واتباع نهج مبسط للكشف عن، تحديد وتوصيف الدرجة 1 integrons وأشرطة الجينات المرتبطة بها في المواد الغذائية وترد (الشكل 2). باستخدام مزيج من زراعة والبلمرة المتسلسل (PCR)، integrons يمكن الكشف عنها بسرعة في المجتمعات البكتيرية معقدة والعزلات الفردية. وترد أساليب لتحديد الأنواع من البكتيريا والتشكل والهوية من أشرطة الجينات المرتبطة integron. هذه الطريقة مناسبة لمجموعة واسعة من الأطعمة النباتية والحيوانية، ويتم إعطاء أمثلة على سير العمل النموذجية لكل من أنواع الطعام هذه.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحديد integrons وأشرطة الجينات المرتبطة بها قد يمثل خطوة رئيسية في توقع ظهور مسببات الأمراض الانتهازية الجديدة، وتتبع مسارات لمسببات الأمراض في السلسلة الغذائية للإنسان، وتحديد مقاومة جديدة والفوعة محددات 8،21،26. وكان الهدف من هذه الورقة لوصف نهج مبسط لفحص عينات ل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بفضل قاعة ميكايلا، لاريسا بيسبو وغوستافو تافاريس للمساعدة التقنية.
Materials
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Used in all PCRs |
| RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) | Sigma | R6513-10MG | Used in all PCRs |
| HinFI restriction enzyme | Promega | R6201 | Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA |
| 100 bp ladder | GE Healthcare | 27400701 | Used as a size standard on all agarose gels |
| GelRed DNA stain | Biotium | 41003 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| Guanidinium Thiocyanate | Life Technologies | AM9422 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| CLS-TC Solution | MP Biomedicals | 6540409 | Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction |
| Lysing Matrix E FastPrep tubes | MP Biomedicals | 116914500 | Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available. |
| binding matrix | MP Biomedicals | 116540408 | Diluted 1:5 with 6M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method. |
| Fast Prep machine | MP Biomedicals | Number of options available | MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information |
References
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
- Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
- Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
- Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
- Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
- Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
- Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
- Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
- Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
- Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
- Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
- Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
- Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
- Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
- Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
- Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
- Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
- Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
- Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
- Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
- Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what’s new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
- Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
- Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
- Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
- Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
- Lane, D. J. . Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , 115-175 (1991).
- Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).
