Screening-Lebensmittel, die für Klasse 1 und Integrons Genkassetten
Summary
This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.
Abstract
Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.
Introduction
Die Entdeckung der Antibiotika war eine der größten wissenschaftlichen Errungenschaften des 20. Jahrhunderts. Allerdings hat der Gebrauch und Missbrauch von Antibiotika, um der raschen Entwicklung von Antibiotika-resistenten Bakterien geführt, und diese nun eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit in das 21. Jahrhundert. Der Aufstieg der Bakterienstämme resistent gegen die meisten Behandlungsmöglichkeiten eröffnet die Möglichkeit, betreten wir eine Ära, in der antimikrobiellen Arzneimitteln nicht mehr wirksam sind 1,2.
Die genetische Maschinerie, die Antibiotika-Resistenz ist ein altes System, Zeit vor Menschen und antibiotischen Selektionsdruck durch Millionen von Jahren 3. Mobile genetische Elemente, wie Plasmiden, Transposons, genomische Inseln integrative konjugativen Elemente und Integrons kann Antibiotikaresistenzgenen (ARG) innerhalb und zwischen den Bakterienspezies 4 verbreiten. Von diesen wurden Integrons eine zentrale Rolle bei der Verbreitung von ARG trotz der spielte,Tatsache, dass sie verlassen sich auf Plasmide und Transposons für die Mobilisierung und das Einsetzen in bakterielle Genome 5. Integrons erfassen Genkassetten mit einem Integron-Integrase und dann zum Ausdruck Kassetten unter Verwendung eines Promotors codiert Integron 6,7 (Abbildung 1). Integron Genkassetten sind kleine mobile Elemente aus einzelnen offenen Leserahmen (ORF), deren Produkte Resistenz gegenüber Antibiotika oder Desinfektionsmittel 8. Klasse 1 Integrons die Integrons am häufigsten aus klinischen Isolaten 5, wo sie zusammen über 130 verschiedene Antibiotikaresistenzgen Kassetten 9 erfasst gewonnen.
Die Verbreitung der Klasse 1 Integrons in menschliche assoziierten kommen und pathogenen Bakterien erzeugt menschlichen Abfallströme, die eine große Zahl von diesen genetischen Elemente 10 enthalten. Schätzungsweise 10 19 Bakterien, die Klasse 1 Integrons enthalten, werden über Klärschlamm pro Jahr i freigegebenn Großbritannien 11. Es ist daher nicht verwunderlich, dass der Klasse 1 Integrons verleihen Antibiotikaresistenzen werden nun in Mikrobiota von wilden Vögel, Fische und andere einheimische Tierwelt 12-14 erkannt. Loslassen Integrons wieder an die Umgebung stellt eine erhebliche Bedrohung der öffentlichen Gesundheit, da Akquisition neuer Gen-Kassetten und komplexe Umlagerungen mit anderen mobilen Elementen auftritt weiterhin, insbesondere in Kläranlagen und anderen Gewässern 15-18. Die natürliche Umwelt wird dann zu einem fruchtbaren Rekrutierungsfeld für neue Resistenzdeterminanten und opportunistische Infektionen 19,20. Novel Integron haltigen Bakterien und neue ARG zurück in die menschliche Gemeinschaft durch verunreinigtes Wasser und Lebensmittel 21,22 umrunden. Überwachung der Umwelt ARG ist eine Schlüsselstrategie für das Verständnis und die Verwaltung Antibiotikaresistenz in der Zukunft 23. Insbesondere sollten ihr Augenmerk auf Nahrungsmittel zu achten, die roh gegessen werden oderleicht gekocht, denn diese stellen die größte Bedrohung für die Übertragung von neuen mobilen Elementen und Krankheitserreger.
In diesem Protokoll einen optimierten Ansatz zur Erfassung, Identifizierung und Charakterisierung der Klasse 1 Integrons und ihre zugehörigen Genkassetten in Lebensmitteln werden skizziert (Abbildung 2). Verwendung einer Kombination von Kultivierung und Polymerasekettenreaktion (PCR) kann Integrons schnell komplexe Bakteriengemeinschaften und individuellen Isolaten nachgewiesen werden. Verfahren zum Identifizieren der Arten von Bakterien und die Konformation und die Identität der Integron assoziierten Genkassetten werden angegeben. Das Verfahren eignet sich für eine breite Palette von pflanzlichen und tierischen Lebensmitteln, und Beispiele für typische Arbeitsabläufe sind für jede dieser Arten von Lebensmitteln gegeben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Identifizierung von Integrons und ihre zugehörigen Gen-Kassetten ist potentiell ein Schlüsselschritt bei der Vorhersage der Entstehung von neuen opportunistischen Erregern, Tracking Wege für Krankheitserreger in die menschliche Nahrungskette, und die Identifizierung neuer Widerstand und Virulenzdeterminanten 8,21,26. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen optimierten Ansatz für das Screening von Proben für die Klasse 1 Integrons, Charakterisierung ihrer Kassette Arrays und Identifizierung der Bakterien…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dank Michaela Hall, Larissa Bispo und Gustavo Tavares für technische Hilfe.
Materials
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Used in all PCRs |
| RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) | Sigma | R6513-10MG | Used in all PCRs |
| HinFI restriction enzyme | Promega | R6201 | Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA |
| 100 bp ladder | GE Healthcare | 27400701 | Used as a size standard on all agarose gels |
| GelRed DNA stain | Biotium | 41003 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| Guanidinium Thiocyanate | Life Technologies | AM9422 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| CLS-TC Solution | MP Biomedicals | 6540409 | Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction |
| Lysing Matrix E FastPrep tubes | MP Biomedicals | 116914500 | Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available. |
| binding matrix | MP Biomedicals | 116540408 | Diluted 1:5 with 6M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method. |
| Fast Prep machine | MP Biomedicals | Number of options available | MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information |
References
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
- Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
- Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
- Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
- Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
- Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
- Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
- Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
- Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
- Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
- Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
- Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
- Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
- Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
- Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
- Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
- Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
- Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
- Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
- Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
- Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what’s new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
- Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
- Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
- Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
- Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
- Lane, D. J. . Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , 115-175 (1991).
- Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).
