Kardiyak çekirdeklerin yoğunluğu sedimentasyon ile izole edilmiş ve akım sitometri kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlemek ve sıralamak için pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) karşı antikorlar ile immunolabeled edilir.
En stratejileri sadece sitoplazmik protein işaretleyicileri 1 güveniyor gibi kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlenmesi doku kesitlerinde zor olmuştur. Gibi çoğalması ve apoptosis gibi kardiyak miyositler Nadir olaylar kardiyak miyosit çekirdeklerinin doğru bir tanımlama homeostazında ve patolojik durumların 2 hücresel yenilenme analiz gerektirir. Burada, pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) ve sonraki akım sitometri sıralama karşı antikorlar ile yoğunluğu sedimantasyon ve immün tarafından otopsi doku kardiyomiyosit çekirdekleri izole etmek için bir yöntem sağlar. Bu strateji, taze doku ve dondurulmuş arşiv malzemesi gayet iyi çalışma avantajı ile yüksek verimlilik analizi ve izolasyon sağlar. Bu da zaten biyobankalar toplanan malzeme çalışma kolaylaştırır. Bu teknik uygulanabilir ve türler, geniş bir aralık içinde test edilmiştir ve karbon-14 3, hücre-CY olarak birden çok alt-uygulamalar için uygundurcle analizi 4, timidin analogları görselleştirme (örneğin BrdU ve DUK) 4, transcriptome ve epigenetik analizi.
Kardiyomiyosit çekirdeklerinin doğru tespit miyokard 2,3 rejeneratif süreçlerinin analizi için çok önemlidir. Taze dokudan kardiyomiyositler izole etmek için, geleneksel teknikler özellikle hücre dışı matris proteinlerine enzimatik sindirimi ve düşük hızlı santrifüjleme ile interstisyel hücreleri daha sonra saflaştırma dayanmaktadır. Embriyonik kök hücreler (ESC) ile yaşayan kardiyomiyositlerin saflaştırma gibi Sirpa 9 veya mitokondriyal boyalar 10 gibi yüzey…
The authors have nothing to disclose.
Biz sitometrisi ile yardım için Marcelo Toro kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, İsveç ve Kalp-Akciğer Vakfı, AB Komisyonu 7.ÇP "CardioCell", İsveç Araştırma Konseyi, AFA sigortalar ve ALF tarafından desteklenmiştir. OB Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından desteklenmiştir.
1. Lysis Buffer |
Name of the reagent |
0.32 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM CaCl2 |
5 mM magnesium acetate |
2.0 mM EDTA |
0.5 mM EGTA |
1 mM DTT |
2. Sucrose buffer |
Name of the reagent |
2.1 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM magnesium acetate |
1 mM DTT |
3. Nuclei storage buffer (NSB plus) |
Name of the reagent |
0.44 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) |
70 mM KCl |
10 mM MgCl2 |
1.5 mM spermine |
Reagents and Equipment | Company |
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam |
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies |
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies |
DRAQ5 | Biostatus |
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences |
Glass douncer (40 ml) and pestle “L” | VWR (Wheaton Industries Inc.) |
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany |
Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany |
Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter |
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR |
Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter |
JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter |
Influx cytometer | Beckman Coulter |
Tube Rotator | VWR |