Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

Summary

Nuclei cardiaca sono isolati tramite sedimentazione densità e immunolabeled con anticorpi contro materiale pericentriolar 1 (PCM-1) per identificare e ordinare nuclei cardiomiociti mediante citometria a flusso.

Abstract

Identificazione dei nuclei cardiomiociti è stato impegnativo in sezioni di tessuto, come la maggior parte delle strategie di contare solo su proteine ​​marker citoplasmatici ^1. Eventi rari in miociti cardiaci quali la proliferazione e l'apoptosi richiedono una identificazione accurata dei miociti cardiaci nuclei di analizzare il rinnovamento cellulare in omeostasi e in condizioni patologiche ^2. Qui, forniamo un metodo per isolare nuclei cardiomyocyte dal tessuto post mortem di sedimentazione densità e immunomarcatura con anticorpi contro materiale pericentriolar 1 (PCM-1) e la successiva selezione citometria a flusso. Questa strategia permette una analisi un elevato throughput e l'isolamento con il vantaggio di lavorare altrettanto bene su tessuti freschi e congelati materiale d'archivio. Ciò rende possibile studiare materiale già raccolto in biobanche. Questa tecnica è applicabile e testato in una vasta gamma di specie e adatto a molteplici applicazioni a valle, come il carbonio-14 datazione ^3, cell-cyCLE analisi ^4, la visualizzazione di analoghi della timidina (ad esempio BrdU e IDU) ^4, l'analisi del trascrittoma ed epigenetici.

Protocol

1. Isolamento dei Nuclei Cardiac Coat tubi ultracentrifuga (Tubi centrifuga Beckman # 363664) con 10 ml di 1% BSA / PBS soluzione di rivestimento. Coprire le provette e farli ruotare per 30 minuti in un rotatore tubo. Rimuovere la soluzione di rivestimento e lasciare la centrifuga tubi aria secca (un tubo per il cuore di topo è richiesto per l'analisi di cuore di topo singoli, alternativamente fino a 5 cuore di topo o 1 g di tessuto cardiaco da una specie diversa (ad esempio umano) può essere elaborato …

Discussion

Identificazione accurata di nuclei cardiomiocita è cruciale per l'analisi dei processi rigenerativi nel miocardio ^2,3. Le tecniche convenzionali per isolare cardiomiociti di tessuto fresco si basa principalmente sulla digestione enzimatica delle proteine ​​della matrice extracellulare e la successiva purificazione dalle cellule interstiziali mediante centrifugazione a bassa velocità. Ulteriore purificazione di cardiomiociti viventi di cellule staminali embrionali (ESC) può essere eseguita da immuno…

Materials

1. Lysis Buffer

Name of the reagent

0.32 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM CaCl2

5 mM magnesium acetate

2.0 mM EDTA

0.5 mM EGTA

1 mM DTT

2. Sucrose buffer

Name of the reagent

2.1 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM magnesium acetate

1 mM DTT

3. Nuclei storage buffer (NSB plus)

Name of the reagent

0.44 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)

70 mM KCl

10 mM MgCl2

1.5 mM spermine

Reagents and Equipment	Company
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415	Abcam
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374	Atlas Antibodies
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm	BD Biosciences
Glass douncer (40 ml) and pestle “L”	VWR (Wheaton Industries Inc.)
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer	IKA Germany
Dispersing tool S25 N-18 G	IKA Germany
Beckman Avanti Centrifuge	Beckman Coulter
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml	VWR
Beckman Centrifuge Tubes #363664	Beckman Coulter
JS13.1 free swinging rotor	Beckman Coulter
Influx cytometer	Beckman Coulter
Tube Rotator	VWR