심장 핵은 밀도 침강 통해 격리 및 유동세포계측법 의해 cardiomyocyte 핵 파악하고 정렬하는 pericentriolar 소재 1 (PCM-1)에 대한 항체로 immunolabeled있다.
대부분의 전략에만 세포질 마커 단백질 1에 의존로 cardiomyocyte 핵의 식별은 조직 섹션에 도전했습니다. 이러한 증식과 apoptosis와 같은 심장 myocytes에서는 드문 행사 심장 myocyte 핵의 정확한 신원은 항상성 및 병리 학적 조건 2의 세포 갱신을 분석해야합니다. 여기서는 pericentriolar 자료 1 (PCM-1)와 후속 유동세포계측법 정렬에 대한 항체가있는 밀도의 침강 및 immunolabeling으로 해부 조직에서 cardiomyocyte 핵을 분리하는 방법을 제공합니다. 이 전략은 신선한 조직 및 냉동 보관 물질에 동일하게 작업의 장점과 높은 처리량 분석 및 절연을 허용합니다. 이렇게하면 이미 biobanks에서 수집한 자료를 공부할 수 있습니다. 이 기술 적용과 종의 광범위한 테스트와 같은 탄소-14 데이트 3 셀 – 사 등 여러 다운 스트림 애플 리케이션에 적합하다CLE 분석 4, thymidine의 analogues의 시각화 (예 : BrdU와 이두) 4, transcriptome 및 epigenetic 분석.
cardiomyocyte 핵의 정확한 신원은 myocardium 2,3의 재생 과정의 분석을 위해 매우 중요합니다. 신선한 조직에서 cardiomyocytes를 분리하기위한 종래의 기술은 주로 세포외 기질 단백질의 소화 효소 및 저속 원심 분리에 의한 간질 세포에서 이후의 정화를 기준으로합니다. 배아 줄기 세포 (ESC)에서 생활 cardiomyocytes의 자세한 정화는 같은 SIRPA 9 또는 mitochondrial 염료 10 표면 마커와 immun…
The authors have nothing to disclose.
우리는 유동세포계측법와 도움 마르셀 토로 인정 싶어요. 이 연구는 스웨덴어 심장과 폐 재단, 유럽위원회는 FP7 "CardioCell", 스웨덴어 연구 협의회, AFA 보험 및 ALF에 의해 지원되었다. OB는 도이치 Forschungsgemeinschaft에 의해 지원되었다.
1. Lysis Buffer |
Name of the reagent |
0.32 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM CaCl2 |
5 mM magnesium acetate |
2.0 mM EDTA |
0.5 mM EGTA |
1 mM DTT |
2. Sucrose buffer |
Name of the reagent |
2.1 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM magnesium acetate |
1 mM DTT |
3. Nuclei storage buffer (NSB plus) |
Name of the reagent |
0.44 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) |
70 mM KCl |
10 mM MgCl2 |
1.5 mM spermine |
Reagents and Equipment | Company |
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam |
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies |
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies |
DRAQ5 | Biostatus |
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences |
Glass douncer (40 ml) and pestle “L” | VWR (Wheaton Industries Inc.) |
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany |
Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany |
Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter |
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR |
Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter |
JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter |
Influx cytometer | Beckman Coulter |
Tube Rotator | VWR |