Noyaux cardiaque sont isolés par sédimentation de densité et immunomarquées avec des anticorps contre matériel péricentriolaire 1 (PCM-1) d'identifier et de trier les noyaux des cardiomyocytes par cytométrie de flux.
Identification des noyaux des cardiomyocytes a été difficile dans des coupes de tissus comme la plupart des stratégies de compter uniquement sur les protéines marqueurs cytoplasmiques 1. Les événements rares dans les myocytes cardiaques tels que la prolifération et l'apoptose nécessite une identification précise des noyaux des myocytes cardiaques pour analyser le renouvellement cellulaire dans l'homéostasie et dans des conditions pathologiques 2. Ici, nous fournissons une méthode pour isoler les noyaux de cardiomyocytes post-mortem des tissus par la sédimentation de densité et immunomarquage avec des anticorps contre le matériel péricentriolaire 1 (PCM-1) et après le tri par cytométrie en flux. Cette stratégie permet une analyse à haut débit et l'isolement avec l'avantage de travailler aussi bien sur les tissus frais et congelés documents d'archives. Cela permet d'étudier des documents déjà recueillis dans des biobanques. Cette technique est applicable et testé dans un large éventail d'espèces et adapté à de multiples applications en aval tels que le carbone-14 datant 3, cellule-cyarticle analyse 4, la visualisation des analogues de la thymidine (BrdU par exemple et les UDI) 4, l'analyse du transcriptome et épigénétiques.
L'identification précise des noyaux des cardiomyocytes est crucial pour l'analyse des processus de régénération dans le myocarde 2,3. Les techniques conventionnelles pour isoler les cardiomyocytes des tissus frais sont principalement basées sur la digestion enzymatique des protéines de la matrice extracellulaire et la purification ultérieure à partir de cellules interstitielles par centrifugation à faible vitesse. Une purification supplémentaire des cardiomyocytes vivant à partir de cellule…
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Marcelo Toro pour l'aide à la cytométrie en flux. Cette étude a été soutenue par le Suédois coeur et du poumon Fondation, la Commission européenne FP7 "CardioCell", Conseil de recherche suédois, AFA assurances et ALF. OB a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft.
1. Lysis Buffer |
Name of the reagent |
0.32 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM CaCl2 |
5 mM magnesium acetate |
2.0 mM EDTA |
0.5 mM EGTA |
1 mM DTT |
2. Sucrose buffer |
Name of the reagent |
2.1 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM magnesium acetate |
1 mM DTT |
3. Nuclei storage buffer (NSB plus) |
Name of the reagent |
0.44 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) |
70 mM KCl |
10 mM MgCl2 |
1.5 mM spermine |
Reagents and Equipment | Company |
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam |
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies |
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies |
DRAQ5 | Biostatus |
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences |
Glass douncer (40 ml) and pestle “L” | VWR (Wheaton Industries Inc.) |
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany |
Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany |
Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter |
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR |
Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter |
JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter |
Influx cytometer | Beckman Coulter |
Tube Rotator | VWR |