心臓核密度沈降を介して分離し、フローサイトメトリーにより心筋細胞核を識別し、ソートするための中心体周辺物質1(PCM-1)に対する抗体で免疫標識されています。
ほとんどの戦略は、唯一の細胞マーカータンパク質1に依存しているとして、心筋細胞の核の同定は、組織切片に挑戦されています。そのような増殖およびアポトーシスとして心筋細胞では稀なイベントは、心筋細胞核の正確な同定は、恒常性と病理学的状態2の細胞の更新を分析する必要があります。ここでは、中心体周辺物質1(PCM-1)およびそれ以降のフローサイトメトリー選別に対する抗体を用いた密度の堆積作用と免疫標識によって死後組織から心筋細胞核を単離する方法を提供します。この戦略は、新鮮な組織と凍結アーカイブ材料にも同様の作業の利点を有するハイスループット解析と分離することができます。これにより、既にバイオバンクで収集された材料を研究することができます。この手法は適用可能で、種の広い範囲でテストし、そのような炭素14年代測定3、セル-CYなどの複数のダウンストリームアプリケーションに適していますCLE分析4、チミジン類似体の可視化(例えば、BrdUとIDU)4、トランスクリプトームとエピジェネティクス解析。
心筋細胞核の正確な識別は、心筋2,3の再生過程の分析のために重要である。新鮮な組織から心筋細胞を分離する従来の手法は、主に細胞外マトリックスタンパク質の酵素消化と低速遠心分離により間質細胞からの後続の精製に基づいています。胚性幹細胞(ESC)から生きている心筋細胞のさらなる精製は、そのようなSIRPA 9またはミトコンドリアの染料10などの表面マ?…
The authors have nothing to disclose.
我々は、フローサイトメトリーの支援についてはマルセロ·トロに感謝したい。本研究では、スウェーデンのハートと肺財団、欧州委員会FP7 "CardioCell"、スウェーデンの研究評議会、AFA保険やALFによってサポートされていました。 OBは、ドイツ学術振興によってサポートされていました。
1. Lysis Buffer |
Name of the reagent |
0.32 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM CaCl2 |
5 mM magnesium acetate |
2.0 mM EDTA |
0.5 mM EGTA |
1 mM DTT |
2. Sucrose buffer |
Name of the reagent |
2.1 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM magnesium acetate |
1 mM DTT |
3. Nuclei storage buffer (NSB plus) |
Name of the reagent |
0.44 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) |
70 mM KCl |
10 mM MgCl2 |
1.5 mM spermine |
Reagents and Equipment | Company |
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam |
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies |
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies |
DRAQ5 | Biostatus |
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences |
Glass douncer (40 ml) and pestle “L” | VWR (Wheaton Industries Inc.) |
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany |
Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany |
Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter |
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR |
Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter |
JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter |
Influx cytometer | Beckman Coulter |
Tube Rotator | VWR |