Núcleos cardíaca são isolados através de sedimentação densidade e immunolabeled com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar e classificar os núcleos dos cardiomiócitos por citometria de fluxo.
Identificação de núcleos de cardiomiócitos tem sido um desafio em cortes de tecido como a maioria das estratégias de contar apenas com proteínas marcadoras citoplasmáticos 1. Eventos raros em miócitos cardíacos, tais como a proliferação e apoptose necessitam de uma identificação precisa dos núcleos dos miócitos cardíacos para analisar a renovação celular e na homeostasia em condições patológicas 2. Aqui, nós proporcionar um método para isolar a partir de núcleos de cardiomiócitos pós tecido mortem por sedimentação densidade e imunomarcação com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) e triagem de citometria de fluxo posterior. Esta estratégia permite uma análise com rendimento elevado e de isolamento, com a vantagem de se trabalhar igualmente bem em tecido fresco e material de arquivo congelado. Isto torna possível estudar o material já recolhidos na biobancos. Esta técnica é aplicável e testado em uma vasta gama de espécies e adequados para várias aplicações tais como a jusante de carbono-14 namoro 3, a célula-cycle análise 4, visualização de análogos da timidina (por exemplo, BrdU e UDI) 4, a análise de transcriptoma e epigenética.
A identificação precisa de núcleos de cardiomiócitos é crucial para a análise dos processos regenerativos no miocárdio 2,3. As técnicas convencionais para isolar cardiomiócitos de tecido fresco baseiam-se principalmente a digestão enzimática de proteínas da matriz extracelular e da subsequente purificação a partir de células intersticiais por centrifugação a baixa velocidade. A purificação adicional de cardiomiócitos de vida a partir de células estaminais embrionárias (ESC) pode ser real…
The authors have nothing to disclose.
Nós gostamos de reconhecer Marcelo Toro para a assistência com a citometria de fluxo. Este estudo foi financiado pelo sueco Coração e Pulmão Foundation, da Comissão Européia, FP7 "CardioCell", Sueco de Pesquisa do Conselho, seguros AFA e ALF. OB foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft.
1. Lysis Buffer |
Name of the reagent |
0.32 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM CaCl2 |
5 mM magnesium acetate |
2.0 mM EDTA |
0.5 mM EGTA |
1 mM DTT |
2. Sucrose buffer |
Name of the reagent |
2.1 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM magnesium acetate |
1 mM DTT |
3. Nuclei storage buffer (NSB plus) |
Name of the reagent |
0.44 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) |
70 mM KCl |
10 mM MgCl2 |
1.5 mM spermine |
Reagents and Equipment | Company |
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam |
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies |
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies |
DRAQ5 | Biostatus |
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences |
Glass douncer (40 ml) and pestle “L” | VWR (Wheaton Industries Inc.) |
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany |
Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany |
Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter |
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR |
Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter |
JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter |
Influx cytometer | Beckman Coulter |
Tube Rotator | VWR |