הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות
Summary
גרעינים לב מבודדים באמצעות שקיעה צפיפות immunolabeled עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) כדי לזהות ולמיין גרעינים cardiomyocyte ידי cytometry הזרימה.
Abstract
זיהוי של גרעיני cardiomyocyte כבר מאתגר בסעיפים רקמות כמו רוב אסטרטגיות לסמוך רק על חלבונים סמן cytoplasmic 1. אירועים נדירים מיוציטים לב כגון התפשטות אפופטוזיס מחייבים זיהוי מדויק של גרעיני myocyte לב לנתח חידוש הסלולר הומאוסטזיס ובתנאים פתולוגיות 2. כאן, אנו מספקים שיטה לבודד את הגרעינים cardiomyocyte מרקמות מורטם הודעה על ידי שקיעה צפיפות immunolabeling עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) ומיון לאחר cytometry הזרימה. אסטרטגיה זו מאפשרת ניתוח התפוקה בידוד גבוה עם יתרון של עובד באותה מידה על רקמות טרי חומר ארכיוני קפוא. זה מאפשר ללמוד החומר שנאסף כבר biobanks. טכניקה זו ישימה ונבדקו מגוון רחב של מינים מתאימים ליישומים רבים במורד הזרם כמו פחמן 14 תיארוך 3, תאים סיCLE ניתוח 4, ויזואליזציה של אנלוגים תימידין (למשל BrdU ו IdU) 4, ניתוח transcriptome ו epigenetic.
Protocol
Discussion
זיהוי מדויק של גרעיני cardiomyocyte הוא קריטי לניתוח תהליכי ההתחדשות של שריר הלב 2,3. טכניקות קונבנציונאלי לבודד מרקמות cardiomyocytes טרי מבוססים בעיקר על עיכול אנזימטי של חלבונים תאי מטריקס וטיהור הבאים מתאי ביניים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה. טיהור נוסף של cardiomyocytes חיי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אוהבים להכיר מרסלו טורו לעזרה עם cytometry הזרימה. מחקר זה נתמך על ידי השוודי לב, ריאות וגם קרן, הנציבות של האיחוד האירופי FP7 "CardioCell", שוודית מועצת המחקר, AFA ביטוחים ו ALF. OB נתמך על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft.
Materials
| 1. Lysis Buffer |
| Name of the reagent |
| 0.32 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM CaCl2 |
| 5 mM magnesium acetate |
| 2.0 mM EDTA |
| 0.5 mM EGTA |
| 1 mM DTT |
| 2. Sucrose buffer |
| Name of the reagent |
| 2.1 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM magnesium acetate |
| 1 mM DTT |
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) |
| Name of the reagent |
| 0.44 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) |
| 70 mM KCl |
| 10 mM MgCl2 |
| 1.5 mM spermine |
| Reagents and Equipment | Company |
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam |
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies |
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies |
| DRAQ5 | Biostatus |
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences |
| Glass douncer (40 ml) and pestle “L” | VWR (Wheaton Industries Inc.) |
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany |
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany |
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter |
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR |
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter |
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter |
| Influx cytometer | Beckman Coulter |
| Tube Rotator | VWR |
References
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).
- Bergmann, O. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science. 324, 98-102 (1126).
- Walsh, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation. Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).
- Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts. Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).
- Adler, C. P., Friedburg, H. Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age. Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).
- Dubois, N. C. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature. 29, 1011-1018 (2011).
- Hattori, F. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7, 61-66 (2010).
- Fransioli, J. Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium. Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).
- Elliott, D. A. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A. Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts. Circulation Research. 90, 634-640 (2002).
- Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation. BMC cell biology. 10, 28 (2009).
- Spoelgen, R. A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain. Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).
- Olivetti, G. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).
- Okada, S. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue. J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).
