Sıçan karaciğerinden portal fibroblastlar izole etmek için bir yöntem tarif edilmiştir. Karaciğerleri perfüze ve sindirilir<em> In situ</em> Kollajenaz ile, takiben<em> Ex vivo</emKaraciğer bulamaç ve hücre boyutuna seçimi> sindirim. Bu yöntem, kültür geçişi için gerek olmaksızın portal fibroblastlann bir saf nüfusu sağlar.
Karaciğer fıbrozda, aktive edilmiş miyofibroblastlar tarafından hücre dışı matris aşırı depozisyonu ile tanımlanır. Karaciğer yıldızsı hücreleri, portal fibroblastlar ve kemik iliğinden elde edilen fibroblast 1 de dahil olmak üzere karaciğer miyofibroblastların birden öncüleri vardır. Karaciğer yıldızsı hücreler en iyi çalışılmış oldu, ama portal fibroblastlar giderek özellikle safra fibrozis 2, myo havuzuna önemli katkı olarak kabul edilmektedir. Portal fibroblastlar potansiyel safra 3-5 skar erken dönemlerinde önemli bir rol oynayan, biliyer epitel hasarına yanıt olarak çoğalma uğrarlar. Portal fibroblastlar izole bir yöntem bu hücre popülasyonunun in vitro çalışma izin ve portal fibroblastlar safra fibrozis oynadığı rolü daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.
Kapı fibroblastlar outgrowth 6, 7 ve Li içeren çeşitli teknikler kullanılarak izole edilmiştirboyutu seçimi 8 izledi enzimatik sindirimi ver perfüzyon. Outgrowth teknikle karşılaştırıldığında sindirim ve boyut seçimi tekniğin avantajı hücreleri kültürüne geçiş gerek kalmadan ele alınabilir olmasıdır. Burada, birincil hücre, saf bir nüfus ile sonuçlanan o sıçan karaciğer portal fibroblastların izolasyonu için Kruglov ve Dranoff 8 tarafından tarif edilen orijinal teknik değiştirilmiş bir sürümü açıklar.
Portal fibroblastlar safra fibrozis önemli bir rol oynamaktadır. Burada, sıçan karaciğer portal fibroblastlar tecrit in vitro bu hücre popülasyonunu incelemek için basit bir yol sağlamak için Kruglov ve Dranoff 8 tarafından yayımlanan orijinal protokolünün bir değişiklik açıklar.
Bu yaklaşım, proteaz sindirim ve boyut tabanlı filtreleme kullanır. Yöntemin önemli avantajı bir hücre oldukça saf nüfusu gen ekspresyonu ya da birkaç gün sonra izole işlevsel bir hücre davranış çalışma sağlayan pasaj kültür gerek kalmadan elde edilebilir olmasıdır. Bu teknik aynı zamanda sağlıklı ve hastalıklı hem karaciğerleri hücreleri izole etmek için bir potansiyel sunmaktadır.
Bu protokolün en önemli adımlardan biri, karaciğer parankiminin enzimatik sindirimi olduğunu. Başarılı bir sindirim sağlamak için, ilk perfu sırasında kan tamamen karaciğer boşaltılır onaylamak için önemlidirHatta karaciğer orada haşlama emin yaparak umulmaktadır. Bunu kolaylaştırmak için, perfüze hafifçe karaciğer masaj pamuklu çubuk kullanmak mümkündür. Canlı hücreler düşük verim karaciğer parankimi sonuçlarının Aşırı sindirim, altı sindirimi zor safra gelen karaciğer parankimi ayırmak için yapacak ise. Pronaz hazırlıkları farklı partiler, kullanılan miktarın optimizasyonu arasındaki enzimatik aktivite değişkenlik olduğundan canlı hücreler, verimleri düşük olduğunda gerekli olabilir.
Bu protokol, portal ven kanüle için daha küçük bir göstergesi IV kateter kullanarak fare karaciğer ya da genç sıçan karaciğer portal fibroblastlar izole hayvan ağırlığı ile orantılı olarak perfüzyon çözümler hacmini azaltarak ve yaklaşık 10 karaciğer perfüzyon oranının azaltılması için modifiye edilebilir ml / dak.
Kültür Portal fibroblastlar gibi α-SMA ex kanıtladığı, 10-14 gün içinde miyofibroblastik farklılaşma tabipression 9. Çeşitli belirteçler fibulin-2 de dahil olmak üzere karaciğer hücreleri stellat, IL-6, elastin, gelen portal fibroblastlar ayırt etmek için kullanılmış olan nükleosit trifosfat diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1 ve böyle sinaptofizin 2, 6, 10, 11 gibi nöronal protein . Bu portal fibroblastlar birkaç gün sonra, kültürün 9 geçirdikten sonra NTPDase2 kaybolur ederken elastin, hatta miyofibroblastik farklılaşma sonra, portal fibroblastlann bir belirteç olduğunu bulduk. Bu nedenle, genellikle elastin için immünofloresan boyama ile portal fibroblastların izolasyonu onaylayın.
Bu tekniğin kısıtlılığı hemen portalı fibroblast izolasyon sonra, Kupffer hücreleri ve safra hücreleri dahil olmak üzere hücre kirleten küçük bir bölümünü orada olmasıdır. Kapı fibroblastlar, saf bir nüfusu (>% 98) 9 veren, ancak, 2-3 gün içinde bu kirletici hücreleri geçmek olacaktır.
Sikültür portalı fibroblast doku kültürü plastik miyofibroblastik farklılaşma geçmesi nce, biz genellikle izolasyon 7 gün içinde bu hücrelerin çalışma. Yöntemleri bölümünde tarif edildiği gibi hücreleri,% 10 fetal sığır serumu içeren portal fibroblast kültür ortamı içinde muhafaza edilir. Bununla birlikte, bu hücrelerin birkaç gün boyunca% 2 fetal sığır serumu içeren büyüme ortamında koruyacaktır. Biz genellikle izolasyon sonra en az 24 saat kadar düşük serum medya kullanmayın. Portal fibroblastlar miyofibroblastik farklılaşma geçmesi bir kez, onlar birkaç kez pasajlandı ve miyofibroblastların dondurulmuş stok olarak tutulabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH R01 DK05823 (RGW için), F32 DK083213 (JWW için), F30 DK081265 (ALO) tarafından ve Fred ve Suzanne Biesecker Pediatrik Karaciğer Merkezi (RGW için) bir hibe ile finanse edildi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |