Техника для изоляции портал фибробластов из печени крыс описана. Печень будут перфузии и усваивается<em> На месте</em> С коллагеназа, а затем<em> Бывший естественных условиях</em> Пищеварения суспензии печени и выбор размера клеток. Этот метод обеспечивает чистый населения портала фибробластов без необходимости перехода в культуре.
Фиброз печени определяется избыточным отложением внеклеточного матрикса активированным миофибробласты. Есть несколько предшественников печени миофибробластов, в том числе печеночных звездчатых клеток, фибробластов портала и костного мозга, полученные фибробласты 1. Звездчатых клеток печени были наиболее изученных, но портал фибробласты чаще рассматривается как важный вклад в миофибробластов бассейна, в частности, в желчные фиброз 2. Портал фибробластов пройти распространение в ответ на повреждения эпителия желчных, потенциально играет ключевую роль в ранней стадии рубцевания желчных 3-5. Метод выделения портал фибробластов позволит в пробирке изучение этой популяции клеток и привести к более глубокому пониманию роли портал фибробласты играют в желчных фиброза.
Портал фибробласты были выделены с помощью различных методов, включая результат 6, 7 и ливерсия перфузии с ферментативного пищеварения следует выбор размера 8. Преимущество пищеварения и техника выбора размера по сравнению с результатом техники является то, что клетки могут быть изучены без необходимости перехода в культуре. Здесь мы описываем модифицированную версию оригинальной методике, описанной Круглов и Dranoff 8 для изоляции портал фибробластов из печени крыс, что приводит к относительно чистой популяции первичных клеток.
Портал фибробласты играют важную роль в желчных фиброза. Здесь мы опишем модификацию оригинального протокола опубликованы Круглов и Dranoff 8 для изоляции портал фибробластов из печени крыс, предоставляя простой способ изучить этот популяции клеток в пробирке.
Этот подход использует пищеварения протеазы и размера на основе фильтрации. Основным преимуществом метода является то, что относительно чистые популяции клеток могут быть получены без перехода в культуре, что позволило изучение экспрессии генов или функциональное поведение клетки через несколько дней после изоляции. Этот метод также предоставляет возможности выделения клеток из здоровых и больных печень.
Одним из наиболее важных шагов в этом протокол ферментативного переваривания печеночной паренхимы. Для обеспечения успешного пищеварения, важно, чтобы убедиться, что кровь полностью вытекла из печени на начальной perfuСион, убедившись, что там даже побледнение печени. Для облегчения этой задачи можно использовать ватный тампон, чтобы массируют печень при перфузии. За-переваривания паренхимы печени приводит к низкой доходности жизнеспособных клеток, а при пищеварении, будет трудно отделить от паренхимы печени желчевыводящих путей. Поскольку препараты проназой есть различия в ферментативной активности между различными партиями, оптимизация количества, используемого может потребоваться, когда существует низкий выход жизнеспособных клеток.
Этот протокол может быть изменен для изоляции портал фибробластов из печени мыши или молодых печени крыс с помощью меньшего калибра IV катетер, чтобы вводить иглу воротной вены, уменьшая объем перфузионные растворы в пропорции к весу животного, а также снижение скорости перфузии печени до 10 мл / мин.
Портал фибробласты в культуре подвергаются myofibroblastic дифференциация в 10-14 дней, о чем свидетельствует α-SMA бывшийВыражение 9. Различные маркеры используются для различения портал фибробластов из печеночных звездчатых клеток, в том числе fibulin-2, IL-6, эластин, нуклеозид трифосфат diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1 и нейронов белки, такие как 2 синаптофизин, 6, 10, 11 . Мы обнаружили, что эластин является хорошим маркером для портала фибробластов, даже после myofibroblastic дифференциации, в то время как NTPDase2 теряется после портал фибробласты подверглись культуры через несколько дней 9. Таким образом, мы, как правило подтвердить изоляции портал фибробластов с помощью иммунофлуоресценции для окрашивания эластина.
Ограничение этого метода является то, что сразу после портал изоляции фибробластов, есть небольшая часть загрязняющих клеток, включая клетки Купфера и желчных клеток. Портал фибробластов перерастет эти загрязняющие клетки в течение 2-3 дней, однако, что дает относительно чистой населения (> 98%) 9.
СиNCE портал фибробласты в культуре подвергаются myofibroblastic дифференциация на ткани пластической культуры, мы обычно изучить эти клетки в течение 7 дней изоляции. Клетки хранятся в портал культуры фибробластов среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, как описано в разделе методов. Однако, эти клетки выживут в питательной среде, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки в течение нескольких дней. Мы обычно не используют низкие сыворотке СМИ по крайней мере 24 часов после изоляции. После портал фибробластов пройти myofibroblastic дифференциации, их можно пассировать в несколько раз и все как замороженные запасы миофибробласты.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась NIH R01 DK05823 (в RGW), F32 DK083213 (для JWW), F30 DK081265 (в АОТ), а также грант от Фреда и Сюзанна Biesecker детской печени центра (в RGW).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |