يوصف تقنية لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد الفئران. وperfused الأكباد وهضمها<em> في الموقع</em> مع كولاجيناز، تليها<em> خارج الحي</em> الهضم من الطين الكبد واختيار حجم الخلايا. هذا الأسلوب يوفر السكان نقية من الخلايا الليفية البوابة دون الحاجة للمرور في الثقافة.
يتم تعريف تليف الكبد عن طريق الترسيب المفرط للالمصفوفة خارج الخلية بواسطة myofibroblasts المنشط. هناك السلائف متعددة من myofibroblasts كبدي، بما في ذلك الخلايا النجمية كبدي، بوابة الليفية ونخاع العظام الخلايا الليفية المشتقة 1. وكانت الخلايا النجمية كبدي أفضل درس، ولكن يتم التعرف على نحو متزايد الليفية بوابة كمساهمين المهم أن تجمع myofibroblast، ولا سيما في التليف الصفراوي 2. الليفية بوابة الخضوع الانتشار استجابة لإصابات الظهارية الصفراوية، ولعب دورا رئيسيا يحتمل أن تكون في المراحل المبكرة من الصفراوية تندب 3-5. وهناك طريقة لعزل الخلايا الليفية بوابة تسمح للدراسة في المختبر من سكان هذه الخلايا وتؤدي إلى مزيد من الفهم لدور الخلايا الليفية بوابة لعب في التليف الصفراوي.
وتم عزل الخلايا الليفية بوابة باستخدام تقنيات مختلفة بما في ذلك ثمرة 6 و 7 و لىالنسخة نضح مع الهضم الأنزيمي تليها اختيار حجم 8. وتستفيد من عملية الهضم وتقنية اختيار حجم مقارنة مع تقنية ثمرة هي التي يمكن دراستها الخلايا دون الحاجة للمرور في الثقافة. هنا، نحن تصف نسخة معدلة من هذه التقنية الأصلية التي وصفها Kruglov وDranoff 8 لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد الفئران أن النتائج في عدد السكان نقي نسبيا من الخلايا الأولية.
الليفية بوابة تلعب دورا هاما في التليف الصفراوي. نحن هنا وصفا لتعديل بروتوكول الأصلية التي نشرتها Kruglov وDranoff 8 لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد الفئران، وتوفير وسيلة مباشرة لدراسة هذه الفئة من السكان الخلايا في المختبر.
هذا النهج يستخدم الهضم البروتيني والترشيح حجم القاعدة. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة التي يمكن الحصول عليها من السكان نقي نسبيا من الخلايا دون مرور في الثقافة، وتمكن من دراسة التعبير الجيني أو وظيفية سلوك الخلية بعد عدة أيام من العزلة. هذا الأسلوب يوفر أيضا القدرة على عزل الخلايا من الكبد على حد سواء صحية ومريضة.
واحدة من الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو الهضم الأنزيمي من لحمة الكبد. لضمان نجاح عملية الهضم، من المهم أن تؤكد ينضب تماما أن الدم من الكبد خلال perfu الأوليةسيون عن طريق التأكد من أن هناك ابيضاض حتى من الكبد. لتسهيل هذا، فمن الممكن استخدام مسحة القطن لتدليك بلطف في الكبد بينما perfusing. الإفراط في هضم نتائج حمة الكبد في تحقيق عائد منخفض من خلايا قابلة للحياة، في حين أن وكيل الهضم سيجعل من الصعب فصل لحمة الكبد من الشجرة الصفراوية. ربما منذ استعدادات pronase يكون التغير في النشاط الأنزيمي بين الكثير مختلفة، وتعظيم الاستفادة من الكمية المستخدمة عندما تكون هناك حاجة إلى وجود عائد منخفض من خلايا قابلة للحياة.
يجوز تعديل هذا البروتوكول لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد فأر أو الشباب كبد الفئران باستخدام أصغر قسطرة الرابع على مقياس يقني؛ يدخل القنية في الوريد البابي، وخفض حجم حلول نضح بما يتناسب مع وزن الحيوان، وخفض معدل نضح الكبد لحوالي 10 مل / دقيقة.
بوابة الليفية في ثقافة الخضوع لتفريق myofibroblastic في 10-14 يوما، كما يتضح من α-SMA السابقينpression 9. وقد استخدمت علامات مختلفة للتمييز بين الخلايا الليفية بوابة من الخلايا النجمية كبدي، بما في ذلك fibulin-2، IL-6، الإيلاستين، نوكليوزيد ثلاثي الفوسفات diphosphohydrolase-2 (NTPDase2)، 1-cofilin وبروتينات الخلايا العصبية مثل synaptophysin 2 و 6 و 10 و 11 . لقد وجدنا أن الإيلاستين هو علامة جيدة لالليفية البوابة، وحتى بعد تمايز myofibroblastic، في حين خسر NTPDase2 بعد الليفية بوابة خضعوا لثقافة بعد عدة أيام 9. ولذلك، فإننا نؤكد عادة عزل الخلايا الليفية المدخل تلطيخ المناعي للالإيلاستين.
الحد من هذه التقنية هو أنه، مباشرة بعد عزل الخلايا الليفية البوابة، وهناك نسبة ضئيلة من الخلايا بما في ذلك تلويث كوبفر والخلايا الصفراوية. والخلايا الليفية بوابة تتفوق هذه الخلايا الملوثة في غضون 2-3 أيام، ومع ذلك، مما يعني أن عدد السكان نقي نسبيا (> 98٪) 9.
SINCE الليفية بوابة في ثقافة الخضوع لتفريق myofibroblastic على البلاستيك زراعة الأنسجة، وعلينا أن ندرس هذه الخلايا عادة في غضون 7 أيام من العزلة. تتم المحافظة على الخلايا في وسائل الإعلام بوابة الثقافة الليفية التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، كما هو موضح في القسم طرق. ومع ذلك، فإن هذه الخلايا البقاء على قيد الحياة في وسائط النمو التي تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني لعدة أيام. نحن عادة لا تستخدم وسائل الاعلام المصل منخفضة حتى 24 ساعة على الأقل بعد العزلة. مرة واحدة تخضع لتمايز الخلايا الليفية بوابة myofibroblastic، يمكن passaged هم عدة مرات، وأبقى كما أسهم المجمدة من myofibroblasts.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 DK05823 (لRGW)، F32 DK083213 (لjww قليلة)، F30 DK081265 (لالو)، وبواسطة منحة من فريد وسوزان الكبد للأطفال Biesecker مركز (لRGW).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |