ラット肝臓からポータル線維芽細胞を単離するための手法が説明されています。肝臓を灌流し、消化され<em>その場で</em>コラゲナーゼで、続いて<em> ex vivoで</em肝臓スラリーと細胞の大きさの選択>消化。このメソッドは、文化の通路を必要とせずにポータル線維芽細胞の純粋集団を提供する。
肝線維症は、活性化線維芽細胞による細胞外マトリックスの過剰堆積によって定義されています。肝星細胞、ポータル線維芽細胞および骨髄由来線維芽細胞の1を含む肝筋線維芽細胞の複数の前駆体は、あります。肝星細胞は、最もよく研究されていますが、ポータル線維芽細胞が増加し、特に胆管線維症2で、筋線維芽細胞プールに重要な貢献者として認められています。ポータル線維芽細胞は、潜在的に胆管瘢痕3-5の初期段階で重要な役割を果たして、胆管上皮損傷に応答して増殖を受けています。ポータル線維芽細胞を単離する方法は、この細胞集団の in vitro試験で許可したポータル線維芽細胞は胆管線維症に果たす役割の理解につながる。
ポータル線維芽細胞が伸長6、7、およびLiを含む様々な技法を用いて単離されたサイズ選択8に続いて酵素消化し たバージョン灌流。伸長技術に比べて消化とサイズの選択方法の利点は、細胞が培養中の通路の必要なしに研究することができるということです。ここでは、初代培養細胞の比較的純粋な人口の結果はラットの肝臓からポータル線維芽細胞を単離するためのKruglovとDranoff 8で記述されたオリジナル技法の修正版を記述します。
ポータル線維芽細胞は胆管線維症において重要な役割を果たしている。ここでは、ラット肝臓からポータル線維芽細胞を分離し、in vitroでこの細胞集団を研究するための簡単な方法を提供するためにKruglovとDranoff 8で掲載されたプロトコルの変更を説明します。
このアプローチは、プロテアーゼ消化とサイズベースのろ過を使用しています。メソッドの主な利点は、セルの比較的純粋な人口は、遺伝子発現または数日間隔離後の機能細胞の挙動の研究を可能にし、文化の中で通過せずに取得することができることである。また、この手法は、健康と病気の両方の肝臓から細胞を単離するための可能性を提供しています。
このプロトコルの中で最も重要なステップの一つは、肝実質領域の酵素消化である。成功した消化性を確保するためには、初期perfu中にその血が完全に肝臓の外に排出されていることを確認することが重要であるさらに肝臓が漂白されていることを確認することによってシオン。これを容易にするためには、灌流しながらゆっくりと肝臓をマッサージして綿棒を使用することが可能です。生細胞の収率が低いの肝実質の結果の過剰消化、下の消化が困難胆道系から肝実質を分離することになりますた。プロナーゼの準備は、異なるロット間の酵素活性の変動を持っているので、生細胞の収率が低いがある場合には、使用量の最適化が必要になることがあります。
このプロトコルは、動物の体重に比例して灌流液の体積を減少し、約10に肝灌流率が減少し、門脈をカニューレを挿入するために小さいゲージIVカテーテルを使用してマウスの肝臓や若いラットの肝臓からポータル線維芽細胞を単離するために変更することができるml /分。
α-SMAの元で明らかなように文化のポータル線維芽細胞は、10〜14日で筋線維芽細胞分化を受ける下り坂9。様々なマーカーは、肝星状フィブリン-2を含む細胞は、IL-6、エラスチン、ヌクレオシド三リン酸-2(NTPDase2)、コフィリン-1やシナプトフィジン2、6、10、11などの神経タンパク質からポータル線維芽細胞を区別するために使用されています。我々は、ポータル線維芽細胞が数日9時より後に文化を受けた後NTPDase2が失われている間エラスチンは、さらに筋線維芽細胞分化後、ポータル線維芽細胞の良いマーカーであることを発見した。したがって、我々は通常、エラスチンのための免疫蛍光染色することにより、ポータル線維芽細胞の分離を確認します。
この手法の限界はすぐにポータル線維芽細胞の分離した後、クッパー細胞と胆管細胞などの汚染のわずかな部分がある、ということです。ポータル線維芽細胞は、比較的純粋な人口(> 98%)9を得た、しかし、2〜3日以内に、これらの混入細胞を脱却します。
Siの文化のポータル線維芽細胞は、組織培養プラスチック上筋線維芽細胞分化を受けるNCEは、一般的に分離7日以内に、これらの細胞を研究しています。メソッドのセクションで説明したように細胞は、10%ウシ胎児血清を含むポータル線維芽細胞培養培地で維持されます。しかし、これらの細胞は数日間、2%ウシ胎児血清を含む増殖培地中で生存します。我々は一般的に分離した後少なくとも24時間まで低血清培地を使用しないでください。ポータル線維芽細胞が筋線維芽細胞分化を受けると、それらは数回継代し、筋線維芽細胞の凍結ストックとして保持することができます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、NIH R01 DK05823(RGWまで)、F32 DK083213(JWWまで)、F30 DK081265(ALOまで)によって、フレッドとスザンヌBiesecker小児肝センター(RGWまで)からの助成金によって賄われていた。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |