쥐의 간장에서 포털 섬유아 세포를 분리를위한 기법을 설명합니다. 간은는 perfused과 소화하고<em> 현장에서</em> collagenase으로 이어<em> 예 생체내</em간 슬러리와 세포 크기의 선택> 소화. 이 방법은 문화의 통과를 위해 필요없이 포털 섬유아 세포의 순수 인구를 제공합니다.
간 섬유증이 활성화 myofibroblasts에 의한 세포외 기질의 과도한 증착에 의해 정의됩니다. 간장 별 모양의 세포, 포털 섬유아 세포 및 골수 유래 섬유아 세포 하나를 포함하여 간장 myofibroblasts의 여러 엽 성의 전구 물질이 있습니다. 간장 별 모양의 전지는 최고의 공부 줬어하지만 포털 섬유아 세포가 점점 특히 담즙의 섬유증 2, myofibroblast 수영장에 중요한 기여자로 인정됩니다. 포털 섬유아 세포는 잠재적으로 담즙이 3-5 흉터의 초기 단계에서 핵심적인 역할을 놀고, 담즙 상피 부상에 대한 응답으로 확산을 받고있다. 포털 섬유아 세포를 분리하는 방식이 세포 인구의 체외 연구에서 허용하고 포털 섬유아 세포가 담즙의 섬유증에서 재생 역할의 큰 이해로 이어질 것입니다.
포털 섬유아 세포가 돋아 나옴 6, 7, 리튬 등 다양한 기술을 사용하여 격리되어사이즈 선택 8 시까지 다음 효소 소화와 버전 재관류. 가지 기법에 비해 소화와 크기를 선택 기법의 장점은 세포 문화에 통과의 필요성없이 공부를 할 수있다는 것입니다. 여기서는 주된 세포의 비교적 순수한 인구시킨 결과가되는 쥐 간암에서 포털 섬유아 세포의 격리를 위해 Kruglov 및 Dranoff 8 시까지 설명한 원래 기술의 수정된 버전을 설명합니다.
포털 섬유아 세포는 담즙의 섬유증의 중요한 역할을한다. 자, 쥐의 간 포털에서 섬유아 세포를 분리해 체외에서이 세포 인구를 공부하는 간단한 방법을 제공하는 Kruglov 및 Dranoff 8 시까지 발행된 원본 프로토콜의 수정에 대해 설명합니다.
이러한 접근 방식은 테아제 소화와 크기를 기반 여과를 사용합니다. 방법의 주요 장점은 세포의 비교적 순수한 인구가 유전자 발현이나 며칠이 고립 후 기능성 세포 행동을 연구함으로써, 문화의 통로없이 얻을 수있다는 것입니다. 이 기술은 또한 건강하고 병에 걸린 간은 모두에서 세포를 분리의 가능성을 제공합니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나는 간장 실질 조직의 효소 소화입니다. 성공적인 소화를 위해, 그것은 초기 perfu 때에 혈액이 완전히 간 밖으로 빠져나간 것을 확인하는 것이 중요하다심지어는 간 상태가 창백되어 있는지 확인함으로써 시온. 이것을 촉진하기 위해서는 perfusing하면서 부드럽게 간이 마사지하기 위해 면봉을 사용할 수 있습니다. 실행 가능한 세포의 낮은 수확량의 간 실질 조직 결과의 이상 – 소화, 이하 – 소화가 어려운 담즙의 나무에서 간 실질 조직을 분리하는 것입니다 동안. pronase의 준비가 다른 많은, 사용 금액의 최적화 간의 효소 활동의 다양성을 가지고 있기 때문에 가능한 세포의 낮은 수율이있을 때 필요한 경우가 있습니다.
이 프로토콜은, 포털 정맥을 cannulate하는 작은 게이지 IV 카테터를 사용하여 마우스 간 또는 젊은 쥐의 간장에서 포털 섬유아 세포를 분리 동물의 무게에 비례하여 재관류 솔루션의 볼륨을 줄이는 약 10 간 재관류 율을 감소를 위해 수정할 수 있습니다 ML / 분.
문화 포털 섬유아 세포는 α-SMA의 전남편에 의해 입증, 10-14 일 myofibroblastic 차별을 받다pression 9. 각종 마커는 fibulin-2를 포함한 간장 별 모양의 세포, IL-6, 엘라스틴에서 포털 섬유아 세포를 구별하는 데 사용되었습니다 뉴클레오 사이드 triphosphate diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1과 같은 synaptophysin 2, 6, 10, 11 등의 연결 단백질 . 우리는 포털 섬유아 세포 며칠 9시 문화받은 후 NTPDase2이 손실되는 동안 엘라스틴은, 심지어 myofibroblastic 분화 이후, 포털 섬유아 세포에 대한 좋은 마커 것으로 나타났습니다. 따라서 일반적으로 엘라스틴을위한 immunofluorescence 염색법에 의해 포털 섬유아 세포의 절연을 확인합니다.
이 기법의 한계는 바로 포털 fibroblast 절연 후, Kupffer 세포 및 담즙의 세포를 포함한 세포를 오염의 작은 분수가라는 점이다. 포털 섬유아 세포는 비교적 순수한 인구 (> 98%) 9하였으며, 그러나, 2-3 일 이내에 이러한 오염 세포를 자라다 것입니다.
시문화 포털 섬유아 세포는 조직 배양 플라스틱에 myofibroblastic 차별을 받다 제정신, 우리는 일반적으로 고립 7 일 이내에 이들 세포를 공부합니다. 방법 섹션에 설명된대로 전지는 10 % 태아 소 혈청을 포함하는 포털 fibroblast 문화 매체에 보관됩니다. 그러나 이러한 세포는 며칠 동안 2% 태아 소 혈청을 포함하는 성장 미디어에서 살아남을 것입니다. 우리는 일반적으로 분리 후 최소 24 시간 전까지는 낮은 혈청 미디어를 사용하지 마십시오. 포털 섬유아 세포가 myofibroblastic 차별을 받다되면, 그들은 여러 번 passaged 및 myofibroblasts의 냉동 주식으로 보관하실 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH R01 DK05823 (RGW까지), F32 DK083213 (JWW까지), F30 DK081265 (ALO까지)에 의해 그리고 프레 드와 수잔 Biesecker 소아과 간 센터 (RGW까지)에서 교부금에 의해 재정 지원되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |