Een techniek voor het isoleren van portal fibroblasten van rat lever wordt beschreven. Levers zijn perfusie en verteerd<em> In situ</em> Met collagenase, gevolgd door<em> Ex vivo</em> Digestie van de lever slurry en de grootte selecteren van cellen. Deze methode levert een zuivere populatie portaal fibroblasten zonder passage in cultuur.
Leverfibrose wordt bepaald door de grote afzetting van extracellulaire matrix door geactiveerde myofibroblasten. Er zijn meerdere voorlopers van de lever myofibroblasten, met inbegrip van leverstellaatcellen, portal fibroblasten en beenmerg afgeleide fibroblasten 1. Leverstellaatcellen zijn de best bestudeerde, maar vergeten fibroblasten worden in toenemende mate erkend als belangrijke bijdrage aan de myofibroblast zwembad, met name in biliaire fibrose 2. Portal fibroblasten proliferatie ondergaan in reactie op biliaire epitheliale letsel, mogelijk een sleutelrol spelen in de vroege stadia van biliaire littekens 3-5. Een methode voor het isoleren van portaalsite fibroblasten in staat zou stellen in vitro studie van deze cel bevolking en tot meer begrip van de rol portal fibroblasten spelen in biliaire fibrose.
Portaal fibroblasten werden geïsoleerd met behulp van diverse technieken zoals uitgroei 6, 7 en liver perfusie met enzymatische afbraak gevolgd door maatselectie 8. Het voordeel van de spijsvertering en maatselectie techniek ten opzichte van de uitwas techniek is dat cellen bestudeerd worden zonder de noodzaak passage in cultuur. Hier beschrijven we een gewijzigde versie van het oorspronkelijke techniek beschreven door Kruglov en Dranoff 8 portal voor isolatie van fibroblasten van rattenlever dat resulteert in een relatief zuivere populatie van primaire cellen.
Portal fibroblasten spelen een belangrijke rol in biliaire fibrose. Hier beschrijven een wijziging van de oorspronkelijke protocol gepubliceerd Kruglov en Dranoff 8 portal voor het isoleren fibroblasten uit rattenlever, die een eenvoudige manier om deze cellen in vitro te bestuderen.
Deze aanpak maakt gebruik van protease spijsvertering en de grootte op basis van filtratie. Het belangrijkste voordeel van de werkwijze is dat een relatief zuivere populatie van cellen kunnen worden verkregen zonder passage in cultuur, waardoor de studie van genexpressie of functionele celgedrag enkele dagen na isolatie. Deze techniek biedt ook de mogelijkheid voor het isoleren van cellen van gezonde en zieke levers.
Een van de meest kritische stappen in dit protocol is de enzymatische vertering van het leverparenchym. Om goed spijsvertering, is het belangrijk dat bloed volledig afgevoerd uit de lever bevestigen tijdens de eerste perfusieCommissie door ervoor te zorgen dat er zelfs wordt het blancheren van de lever. Om dit mogelijk te maken, is het mogelijk om een wattenstaafje gebruiken om zachtjes masseren van de lever, terwijl perfuseren. Over-digestie van het leverparenchym resulteert in een lage opbrengst van levensvatbare cellen, terwijl onder-digestie zal bemoeilijken de leverparenchym scheiden van de galwegen. Omdat de voorbereidingen van pronase hebben variabiliteit in enzymatische activiteit tussen de verschillende partijen, optimalisatie van de gebruikte hoeveelheid kan nodig zijn wanneer er lage opbrengst van levensvatbare cellen.
Dit protocol kan worden aangepast voor het isoleren van portal fibroblasten van muizen lever-of jonge rat lever met behulp van een kleinere maat IV katheter naar de poortader canule, het verminderen van het volume van de bloedtransfusie-oplossingen in verhouding tot dieren gewicht, en het verminderen van de leverperfusie percentage op ongeveer 10 ml / min.
Portal fibroblasten in de cultuur ondergaan myofibroblastic differentiatie in 10-14 dagen, zoals blijkt uit α-SMA expressie 9. Verschillende markers zijn gebruikt om portaal fibroblasten onderscheiden leverstellaatcellen, zoals fibulin-2, IL-6, elastine, nucleoside trifosfaat diphosphohydrolase-2 (NTPDase2) cofilin-1 en neuronale eiwitten zoals synaptophysine 2, 6, 10, 11 . Wij hebben gevonden dat een goed elastine marker voor portaal fibroblasten, zelfs na myofibroblastic differentiatie, terwijl NTPDase2 verdwijnt na portaal fibroblasten ondergaan cultuur na enkele dagen 9. Daarom hebben we meestal te bevestigen isolatie van portale fibroblasten door immunofluorescentiekleuring voor elastine.
De beperking van deze techniek is dat, direct na portaal fibroblast isolatie is een klein gedeelte van contaminerende cellen inclusief Kupffer-cellen en gal cellen. Portaal fibroblasten zullen groeien deze verontreinigende cellen binnen 2-3 dagen echter waarbij een relatief zuivere populatie (> 98%) 9.
SiNVU-portaal fibroblasten in de cultuur te ondergaan myofibroblastic differentiatie op weefselkweek plastic, hebben we meestal te bestuderen deze cellen binnen de 7 dagen van isolatie. Cellen worden gehandhaafd portaal fibroblast kweekmedia dat 10% foetaal runderserum, zoals beschreven in de volgende sectie. Maar deze cellen overleven groeimedia met 2% foetaal bovine serum enkele dagen. We hebben meestal geen gebruik maken van lage serum media tot minstens 24 uur na isolatie. Zodra portal fibroblasten ondergaan myofibroblastic differentiatie, kunnen ze worden gepasseerd meerdere malen en bleef als bevroren voorraden myofibroblasten.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door NIH R01 DK05823 (tot RGW), F32 DK083213 (om JWW), F30 DK081265 (tot ALO), en door een subsidie van het Fred en Suzanne Biesecker Pediatric Lever Center (tot RGW).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |