Eine Technik zur Isolierung Portal Fibroblasten aus Rattenleber beschrieben. Lebern werden perfundiert und verdaut<em> In-situ-</em> Mit Kollagenase, gefolgt von<em> Ex vivo</em> Verdauung der Leber Gülle und Größe Auswahl von Zellen. Diese Methode stellt eine reine Population von Fibroblasten-Portal ohne die Notwendigkeit für den Durchgang in der Kultur.
Leberfibrose ist durch die übermäßige Ablagerung von extrazellulärer Matrix durch aktivierte Myofibroblasten definiert. Es gibt mehrere Vorläufer der hepatischen Myofibroblasten, einschließlich hepatische Sternzellen-, Portal-Fibroblasten und Knochenmark stammenden Fibroblasten ein. Hepatischen Sternzellen waren die am besten untersuchte, sondern Portal Fibroblasten werden zunehmend als wichtige Faktoren für die Myofibroblasten Pool anerkannt, insbesondere in biliären Fibrose 2. Portal Fibroblasten unterziehen Proliferation als Reaktion auf biliären Epithelzellen Verletzungen, möglicherweise eine wichtige Rolle spielen in den frühen Stadien der Gallenwege Narben 3-5. Ein Verfahren zur Isolierung Portal Fibroblasten in vitro-Studie würde dieser Zellpopulation ermöglichen und führen zu einem besseren Verständnis der Rolle Portal Fibroblasten spielen in biliären Fibrose.
Portal Fibroblasten wurden isoliert unter Verwendung verschiedener Techniken wie Auswachsen 6, 7 und liver. Perfusion mit enzymatische Verdauung von Größenauswahl 8 an. Der Vorteil der Verdauung und Größe Selektionstechnik gegenüber dem Auswachsen Technik ist, dass Zellen ohne die Notwendigkeit der Passage in Kultur untersucht werden können. Hier beschreiben wir eine modifizierte Version der ursprünglichen Technik von Kruglov und Dranoff 8 zur Isolierung von Portal Fibroblasten aus Rattenleber, dass in einer relativ reinen Population von primären Zellen beschriebenen Ergebnisse.
Portal Fibroblasten spielen eine wichtige Rolle in biliären Fibrose. Hier beschreiben wir eine Modifikation des ursprünglichen Protokolls von Kruglov und Dranoff 8 zur Isolierung Portal Fibroblasten aus Rattenleber und bietet eine unkomplizierte Möglichkeit, diese Zellpopulation in vitro Studie veröffentlicht.
Dieser Ansatz verwendet Proteaseverdau und Größe-basierte Filterung. Der primäre Vorteil des Verfahrens ist, dass eine relativ reine Population von Zellen ohne Passage in Kultur erhalten werden kann, so dass die Untersuchung der Genexpression oder funktionelle Verhalten der Zelle mehrere Tage nach der Isolierung. Diese Technik bietet auch das Potenzial zur Isolierung von Zellen aus sowohl gesunden und kranken Lebern.
Einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist die enzymatische Verdauung des Leberparenchyms. Um eine erfolgreiche Verdauung zu gewährleisten, ist es wichtig, um zu bestätigen, dass das Blut vollständig aus der Leber abgeleitet während der anfänglichen PerfusionSion, indem sichergestellt wird, dass es sogar Blanchieren der Leber. Um dies zu erleichtern, ist es möglich, ein Wattestäbchen verwenden, um sanft massieren, während die Leber Perfusion. Mehr als-Verdau der Leberparenchym führt zu einer niedrigen Ausbeute von lebensfähigen Zellen, während sie unter-Verdau wird es schwierig, die Leberparenchym aus der Gallenwege zu trennen. Da Zubereitungen Pronase Variabilität in der enzymatischen Aktivität zwischen verschiedenen Chargen, Optimierung der Menge verwendet werden, haben kann notwendig, wenn es geringer Ausbeute von lebensfähigen Zellen werden.
Dieses Protokoll kann zum Isolieren Portal Fibroblasten aus Mausleber oder junge Rattenleber mit einem geringeren Durchmesser IV-Katheter, die Pfortader Kanülierung, Verringern des Volumens der Perfusionslösungen im Verhältnis zu Tiergewicht, und Verringern der Leber Perfusionsrate bis etwa 10 modifiziert werden ml / min.
Portal Fibroblasten in Kultur zu unterziehen myofibroblastischer Differenzierung in 10-14 Tagen, wie von α-SMA ex belegtpression 9. Verschiedene Marker wurden verwendet, um Portal-Fibroblasten von hepatischen Sternzellen, einschließlich Fibulin-2, IL-6, Elastin, unterscheiden Nukleosidtriphosphat Diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), Cofilin-1 und neuronale Proteine wie Synaptophysin 2, 6, 10, 11 . Wir haben festgestellt, dass Elastin ein guter Marker für Fibroblasten-Portal ist, auch nach myofibroblastischer Differenzierung, während NTPDase2 geht verloren, nachdem Portal Fibroblasten Kultur nach einigen Tagen 9 unterzogen worden sind. Deshalb haben wir in der Regel bestätigen Isolierung von Portal-Fibroblasten durch Immunfluoreszenzfärbung für Elastin.
Der Nachteil dieser Technik ist, dass unmittelbar nach Portal Fibroblasten isoliert, gibt es einen kleinen Bruchteil der kontaminierenden Zellen einschließlich Kupffer-Zellen und Gallen-Zellen. Portal Fibroblasten wird diese kontaminierenden Zellen in 2-3 Tagen zu klein wird, jedoch so dass ein relativ reine Population (> 98%) 9.
Since Portal Fibroblasten in Kultur myofibroblastischer Differenzierung durchlaufen auf Gewebekultur-Plastik, wir studieren diese Zellen normalerweise innerhalb von 7 Tagen der Isolation. Die Zellen werden in Portal Fibroblastenkultur Medium, das 10% fötales Rinderserum gehalten, wie in dem Verfahrensabschnitt beschrieben. Allerdings werden diese Zellen in Wachstumsmedium, enthaltend 2% fötales Rinderserum mehrere Tage überleben. Wir verwenden normalerweise keine niedrigen Serum-Medien bis spätestens 24 Stunden nach der Isolierung. Sobald Portal Fibroblasten myofibroblastischer Differenzierung durchlaufen, können sie mehrmals passagiert werden und gehalten als gefrorene Vorräte an Myofibroblasten.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom NIH R01 DK05823 (bis RGW), F32 DK083213 (bis JWW), F30 DK081265 (zu ALO), und durch einen Zuschuss aus dem Fred und Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (bis RGW) gefördert.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |