Testes de susceptibilidade antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis é um desafio, mas fundamental para o atendimento ao paciente. Este formato de placa de microtitulação oferece testes de 12 drogas antimicobacterianos e fornece concentração inibitória mínima (MIC) valores, o que ajudará no tratamento adequado.
A rápida detecção de resistência aos antimicrobianos é importante no esforço para controlar o aumento da resistência do Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Testes de susceptibilidade antimicrobiana (AST) de Mtb tem sido tradicionalmente realizada pelo método de agar de proporção ou por meio de testes macrobroth em um instrumento como o BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) ou BacT / ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). O método das proporções em ágar, enquanto considerado o padrão "ouro" da AST, é trabalhoso e requer o cálculo de resistência através da realização de contagem de colônias em ágar contendo drogas em relação ao livre de drogas agar. Se houver ≥ crescimento de 1% no meio de drogas que contêm, em comparação com drogas meio livre, o organismo é considerado resistente a esta droga. Os métodos macrobroth requerem instrumentação e ponto de teste de quebra ("crítica"), as concentrações da droga para os medicamentos de primeira linha (isoniazida, etambutol, rifampicina e pirazinamida). O método descrito aqui é comercialmente disponível em um formato de 96 poços de microtitulação placa [MYCOTB (TREK Diagnostics)] e contém concentrações crescentes de 12 antimicrobianos utilizados para o tratamento de tuberculose, incluindo ambos os primeiro (isoniazida, rifampicina, etambutol) e medicamentos de segunda linha (amicacina, cicloserina, etionamida, canamicina, a moxifloxacina, ofloxacina, para-aminossalicílico, rifabutina, e estreptomicina). Pirazinamida, uma droga de primeira linha, não está incluído na placa de microtitulação, devido à sua necessidade de condições de teste ácido. Vantagens do sistema de microtitulação incluem tanto a facilidade de configurar e mais rápido por sua vez em torno do tempo (14 dias) em comparação com proporção tradicionais com ágar (21 dias). Além disso, a placa pode ser configurada a partir de inóculo preparado usando o caldo de carne ou meio sólido. Desde o formato microplaca é novo e desde Mtb apresenta desafios únicos de segurança no laboratório, este protocolo irá descrever como a segurança de instalação, incubar e ler a placa de microtitulação.
Um exemplo de uma placa de microtitulação AST que controla o crescimento positivo é mostrado na Figura 1 e do MIC endpoint (mg / ml) para cada droga é um círculo. Um estudo realizado em nosso laboratório indicaram que a placa de microtitulação AST método é equivalente ao método de proporção padrão agar ouro para testes de susceptibilidade do Mycobacterium tuberculosis. Mais rápido relato dos resultados foi obtida com microtitulação placa de microtitulação AST quando comparado ao método tradicional agar proporção com a interpretação final para AST placa de microtitulação e método das proporções em ágar 14 e 21 dias, respectivamente.A AST placa de microtitulação tem a vantagem de testar primeiro e segunda linha de medicamentos simultaneamente, o que pode ajudar a prevenir morosidade excessiva com cepas resistentes. O AST placa de microtitulação também é muito mais fácil de configurar e ler que a APM e ambos espelho um manual e um sistema semi-automático como o Vizion pode ser usado para ler as placas. A disponibilidade de um valor de MIC para TB testes de resistência poderiam fornecer novas informações valiosas para os médicos em relação ao valor tradicional concentração crítica, especialmente para aqueles isolados com susceptibilidade "borderline".
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer aos técnicos de laboratório da Clínica Mayo Micobactérias laboratório por sua ajuda durante o estudo.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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AST microtiter plates and adhesive seal | TREK Diagnostics, Cleveland Ohio | MYCOTB |
McFarland 0.5 standard | TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio | E1041 |
Middlebrook 7H10 plates | Fisher | |
Blood Agar Plates | Fisher | |
Sterile loops 1 μL | Fisher | |
Sterile loops 10 μL | Fisher | |
Sensititre Saline-Tween glass bead broth | TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio | 27143 |
7H9 OADC Broth | TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio | T3440 |
Long Pipet Tips | Fisher | |
Sterile Troughs | TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio | |
M. tuberculosis | ATCC | 27294 |
Pipeters: 1000, 200, 20μL | Fisher | |
Tips 1000, 20, 20 μL | Fisher | |
Multichannel Pipetter | Fisher | |
Incubator 5-10% CO2 | Fisher | |
Plastic bags, small, CO2 permeable | Poly Plastic, Delano, PA | |
TB disinfectant (Such as ProSpray C-60) | Certol International, Commerce City, CO | PSC60/32 |
Mirror Box Reader | Fisher |