Lakrimal Bez Kök Hücreleri için Üç Boyutlu, Serumsuz Kültür Sistemi
Summary
Yetişkin lakrimal bez (LG) kök hücreleri için üç boyutlu, serumsuz kültür yöntemi, LG organoid oluşumunun indüksiyonu ve asinar veya duktal benzeri hücrelere farklılaşması için iyi bir şekilde kurulmuştur.
Abstract
Lakrimal bez (LG) kök hücre bazlı tedavi, lakrimal bez hastalıkları için umut verici bir stratejidir. Bununla birlikte, yeterli sayıda LG kök hücresi (LGSC) elde etmek için güvenilir, serumsuz bir kültür yönteminin bulunmaması, daha fazla araştırma ve uygulama için bir engeldir. Yetişkin fare LGSC’leri için üç boyutlu (3D), serumsuz kültür yöntemi iyi kurulmuş ve burada gösterilmiştir. LGSC’ler sürekli olarak geçirilebilir ve asinar veya duktal benzeri hücrelere farklılaşmak için indüklenebilir.
LGSC birincil kültürü için, 6-8 haftalık farelerden gelen LG’ler dispaz, kollajenaz I ve tripsin-EDTA ile sindirildi. Toplam 1 × 10 4 tek hücre,20 μL matris jel-LGSCM matrisi ile önceden kaplanmış, 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğunda 80 μL matris jel-lakrimal bez kök hücre ortamı (LGSCM) matrisine tohumlandı. Karışım, 37 ° C’de 20 dakika boyunca inkübasyondan sonra katılaştı ve 600 μL LGSCM eklendi.
LGSC bakımı için, 7 gün boyunca kültürlenen LGSC’ler, dispase ve tripsin-EDTA ile tek hücrelere ayrıştırıldı. Tek hücreler LGSC primer kültüründe kullanılan yönteme göre implante edildi ve kültürlendi. LGSC’ler 40 defadan fazla geçiş yapabilir ve kök / progenitör hücre belirteçleri Krt14, Krt5, P63 ve nestini sürekli olarak eksprese edebilir. LGSCM’de kültürlenen LGSC’ler kendini yenileme kapasitesine sahiptir ve in vitro ve in vivo olarak asinar veya duktal benzeri hücrelere farklılaşabilir.
Introduction
Lakrimal bez kök hücreleri (LGSC’ler) lakrimal bez (LG) hücre yenilenmesini sürdürür ve asinar ve duktal hücrelerin kaynağıdır. Bu nedenle, LGSC transplantasyonu ciddi inflamatuar hasarın ve sulu eksikliği olan kuru göz hastalığının (ADDED) tedavisinde alternatif bir yaklaşım olarak kabul edilir1,2,3. Tiwari ve ark. çeşitli büyüme faktörleri ile desteklenmiş kollajen I ve matris jeli kullanarak birincil LG hücrelerini ayırmış ve kültüre almış; ancak LG hücreleri sürekli kültürlenemedi4. İki boyutlu (2D) kültür kullanılarak, fare LG’sinden türetilmiş kök hücreler You ve ark.5 ve Ackermann ve ark. tarafından izole edilmiştir. 6, kök / progenitör hücre belirteci genlerini, Oct4, Sox2, Nanog ve nestini eksprese ettiği bulundu ve alt kültürlenebilir. Bununla birlikte, bu hücrelerin asinar veya duktal hücrelere farklılaşabileceğine dair net bir gösterge yoktur ve in vivo farklılaşma potansiyelini doğrulamak için bir transplantasyon deneyi yoktur.
Son zamanlarda, c-kit + dim / EpCAM + / Sca1 – / CD34 – / CD45– hücreleri, akış sitometrisi ile fare LG’lerinden izole edildi, Pax6 ve Runx1 gibi LG progenitör hücre belirteçlerini eksprese ettiği bulundu ve in vitro olarak kanallara ve acini’ye farklılaştı. ADDED’li farelerde, bu hücrelerle ortotopik enjeksiyon, hasarlı LG’leri onarabilir ve LG’lerinsalgı fonksiyonunu geri yükleyebilir 2. Bununla birlikte, bu yöntemle izole edilen kök hücrelerin sayısı azdı ve izole LGSC’leri genişletmek için uygun kültür koşulları yoktu. Özetle, yetişkin LGSC’leri etkin bir şekilde izole etmek ve kültürlemek için uygun bir kültür sisteminin kurulması ve ADD’lerin tedavisinde LGSC’lerin incelenmesi için istikrarlı ve sürekli genişleme sağlanmalıdır.
Kök hücrelerden veya pluripotent kök hücrelerden türetilen organoidler, histolojik olarak ilgili organlara benzeyen ve kendi yenilenmelerini sürdürebilen bir hücre grubudur. Fare bağırsağı organoidi 2009 yılında Sato ve ark. tarafından başarıyla kültürlendikten sonra, safra kesesi8, karaciğer9, pankreas 10, mide 11, meme12, akciğer13, prostat 14 ve tükürük bezi15 gibi Sato’nun kültür sistemine dayanarak, diğer organlardan gelen organoidler art arda kültürlendi. . Organoid kültürde hücre farklılaşmasından önce yetişkin kök hücrelerin yüksek oranda olması nedeniyle, üç boyutlu (3D) organoid kültür yöntemi, LG’nin yetişkin kök hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için en uygun olarak kabul edilir.
Bu çalışmada 3D, serumsuz kültür yöntemi optimize edilerek yetişkin fare LGSC kültür sistemi kurulmuştur. Hem normal hem de ADDED farelerden kültürlenen LGSC’lerin istikrarlı bir kendini yenileme ve çoğalma kapasitesi gösterdiği kanıtlanmıştır. ADDED fare LG’lerine transplantasyondan sonra, LGSC’ler bozulmuş LG’leri kolonize etti ve gözyaşı üretimini geliştirdi. Ek olarak, kırmızı floresan LGSC’ler ROSA26mT / mG farelerden izole edildi ve kültürlendi. Bu çalışma, ADDED tedavisi için klinik uygulamada in vitro LGSC zenginleştirmesi ve LGSC otogreft için güvenilir bir referans sağlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lakrimal kök hücre kültürü ve LG yaralanma onarımı için lakrimal kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro kültürü için iyi kurulmuş yöntemler vardır. Shatos ve ark.17 ve Ackermannve ark. Sıçan ve farelerin sırasıyla 2D kültür yöntemleriyle başarılı bir şekilde kültürlenmiş ve alt kültürlenmiş lakrimal kök hücreleri, ADD tedavisi için lakrimal kök hücrelerin naklini mümkün kılmaktadır. 2D olara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (No. 31871413) ve iki Guangdong Bilim ve Teknoloji Programından (2017B020230002 ve 2016B030231001) bir hibe ile desteklenmiştir. Çalışma sırasında bize yardımcı olan araştırmacılara ve hayvan merkezinde çalışan personele hayvan bakımına verdikleri destek için gerçekten minnettarız.
Materials
| Animal(Mouse) | |||
| Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
| NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| Equipment | |||
| Analytical balance | Sartorius | ||
| Automatic dehydrator | Thermo | ||
| Blood counting chamber | BLAU | ||
| Cell Counter | CountStar | ||
| CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
| ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
| Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
| Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
| Frozen tissue slicer | Lecia | ||
| Horizontal centrifuge | CENCE | ||
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
| Liquid nitrogen container | Thermo | ||
| Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Microwave oven | Panasonic | ||
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
| Paraffin slicing machine | Thermo | ||
| PCR Amplifier | Eppendorf | ||
| pH value tester | Sartorius | ||
| 4 °C Refrigerator | Haier | ||
| Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
| Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
| -80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| -20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| Ultra pure water purification system | ELGA | ||
| Reagent | |||
| Animal Experiment | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
| Cell Culture | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE staining & Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
| Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
| Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
| Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
| Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
| Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
| Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
| Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
| Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
| Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | – | |
| Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction & Cell Transfection | |||
| Agar | OXID | – | |
| Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
| LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
| Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID | – | |
| Yeast Extract | OXID | – | |
| Primers and Sequence | Company | ||
| Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |
References
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
- Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
- Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
- You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
- Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
- Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
- Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
- Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren’s syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
- Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).
