Summary

Driedimensionaal, serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen

Published: June 02, 2022
doi:

Summary

De driedimensionale, serumvrije kweekmethode voor volwassen traanklier (LG) stamcellen is goed ingeburgerd voor de inductie van LG organoïde vorming en differentiatie in acinaire of ductaal-achtige cellen.

Abstract

Traanklier (LG) stamcel-gebaseerde therapie is een veelbelovende strategie voor traanklieraandoeningen. Het ontbreken van een betrouwbare, serumvrije kweekmethode om een voldoende aantal LG-stamcellen (LGSC’s) te verkrijgen, is echter een obstakel voor verder onderzoek en toepassing. De driedimensionale (3D), serumvrije kweekmethode voor LGSC’s voor volwassen muizen is goed ingeburgerd en wordt hier getoond. De LGSC’s kunnen continu worden gepasseerd en geïnduceerd om te differentiëren tot acinaire of ductaalachtige cellen.

Voor de LGSC primaire cultuur werden de PG’s van 6-8 weken oude muizen verteerd met dispase, collagenase I en trypsine-EDTA. Een totaal van 1 × 104 enkele cellen werden gezaaid in 80 μL matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in elke put van een 24-well plaat, vooraf gecoat met 20 μL matrix gel-LGSCM matrix. Het mengsel werd gestold na incubatie gedurende 20 minuten bij 37 °C en 600 μL LGSCM toegevoegd.

Voor LGSC-onderhoud werden LGSC’s die gedurende 7 dagen werden gekweekt, uitgesplitst in afzonderlijke cellen door dispase en trypsine-EDTA. De afzonderlijke cellen werden geïmplanteerd en gekweekt volgens de methode die werd gebruikt in de primaire cultuur van LGSC. LGSC’s kunnen meer dan 40 keer worden gepasseerd en continu stam/ voorlopercelmarkers Krt14, Krt5, P63 en nestin uitdrukken. LGSC’s gekweekt in LGSCM hebben zelfvernieuwingscapaciteit en kunnen in vitro en in vivo differentiëren in acinaire of ductaalachtige cellen.

Introduction

Traanklier stamcellen (LGSCs) onderhouden traanklier (LG) celvernieuwing en zijn de bron van acinaire en ductale cellen. Daarom wordt LGSC-transplantatie beschouwd als een alternatieve benadering voor de behandeling van ernstige ontstekingsschade en waterig-deficiënte droge ogenziekte (ADDED)1,2,3. Verschillende kweekmethoden zijn toegepast om LGSC’s te verrijken. Tiwari et al. scheidden en kweekten primaire LG-cellen met behulp van collageen I en matrixgel aangevuld met verschillende groeifactoren; de LG-cellen konden echter niet continu worden gekweekt4. Met behulp van tweedimensionale (2D) cultuur werden van LG afgeleide stamcellen van muizen geïsoleerd door You et al.5 en Ackermann et al. 6, gevonden om de stam / voorlopercelmarkergenen, Oct4, Sox2, Nanog en nestin, tot expressie te brengen en kan worden gesubcultureerd. Er zijn echter geen duidelijke aanwijzingen dat deze cellen kunnen differentiëren in acinaire of ductale cellen, en er is geen transplantatie-experiment om het differentiatiepotentieel in vivo te verifiëren.

Onlangs werden c-kit + dim / EpCAM + / Sca1/ CD34/CD45-cellen geïsoleerd uit muis-PG’s door flowcytometrie, bleken LG-voorlopercelmarkers tot expressie te brengen, zoals Pax6 en Runx1, en gedifferentieerd in kanalen en acini in vitro. Bij muizen met ADDED kan orthotopische injectie met deze cellen beschadigde PG’s herstellen en de secretoire functie van PG’s2 herstellen. Het aantal stamcellen dat door deze methode werd geïsoleerd, was echter klein en er zijn geen geschikte kweekomstandigheden voor het uitbreiden van de geïsoleerde LGSC’s. Samenvattend moet een passend kweeksysteem worden opgezet om volwassen LGSC’s effectief te isoleren en te kweken met stabiele en continue uitbreiding voor de studie van LGSC’s bij de behandeling van ADDED.

Organoïden afgeleid van stamcellen of pluripotente stamcellen zijn een groep cellen die histologisch vergelijkbaar zijn met de verwante organen en hun eigen vernieuwing kunnen behouden. Nadat de darmorganoïde van de muis in 2009 met succes werd gekweekt door Sato et al.7, werden organoïden uit andere organen achtereenvolgens gekweekt, op basis van het kweeksysteem van Sato, zoals galblaas8, lever9, pancreas10, maag11, borst12, long13, prostaat14 en speekselklier15 . Vanwege het hoge aandeel volwassen stamcellen vóór celdifferentiatie in organoïde cultuur, wordt de driedimensionale (3D) organoïde kweekmethode als optimaal beschouwd voor de isolatie en kweek van volwassen stamcellen van LG.

Een LGSC-kweeksysteem voor volwassen muizen werd in deze studie opgezet door de 3D, serumvrije kweekmethode te optimaliseren. Het is bewezen dat de LGSC’s gekweekt uit zowel normale als TOEGEVOEGDE muizen een stabiel vermogen tot zelfvernieuwing en proliferatie vertoonden. Na transplantatie in de ADD-muis-PG’s koloniseerden LGSCs de aangetaste PG’s en verbeterden ze de traanproductie. Bovendien werden rode fluorescerende LGSC’s geïsoleerd uit ROSA26mT/mG-muizen en gekweekt. Dit werk biedt een betrouwbare referentie voor LGSC-verrijking in vitro en LGSC-autograft in klinische toepassing voor TOEGEVOEGDE therapie.

Protocol

Alle experimenten in dit protocol volgden de richtlijnen voor dierverzorging van de Ethische Commissie voor Dierproeven van Sun Yat-sen University. Alle celgerelateerde bewerkingen moeten worden uitgevoerd op de ultraschone werkbank in de celoperatiekamer. Alle bewerkingen met xyleen moeten worden uitgevoerd in zuurkasten. 1. LGSC primaire cultuur LG isolatie Verkrijg een 6-8 weken oude BALB / c mannelijke muis en snijd de huid achter het oor om de LG en het …

Representative Results

3D, serumvrij kweeksysteem opzettenIn deze studie werd LGSCM met EGF, Wnt3A, FGF10 en Y-27632 voor muis LGSC’s ontwikkeld en werden LGSC’s met succes geïsoleerd en gekweekt door een 3D-kweekmethode (figuur 1A). Een succesvol 3D, serumvrij kweeksysteem van LGSC’s van C57BL/6 muizen, NOD/ShiLtJ muizen, BALB/c muizen en ROSA26mT/mG muizen is vastgesteld met behulp van deze methode16. Voor een mannelijke muis werden 1,5-2 × 106…

Discussion

Er zijn gevestigde methoden voor de isolatie en in vitro kweek van traanstamcellen voor traanstamcelkweek en LG-letselherstel. Shatos et al.17 en Ackermannet al. 6 succesvol gekweekte en subculturele traanstamcellen van ratten en muizen door respectievelijk 2D-kweekmethoden, waardoor het mogelijk is om traanstamcellen te transplanteren voor de behandeling van ADDED. Studies op stamcellen18 en mesenchymale stamcellen<sup class="xref"…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (nr. 31871413) en twee programma’s van Guangdong Science and Technology (2017B020230002 en 2016B030231001). We zijn de onderzoekers die ons hebben geholpen tijdens het onderzoek en de medewerkers die in het dierencentrum werken echt dankbaar voor hun steun in de dierverzorging.

Materials

Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID
Yeast Extract OXID
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC
Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG
Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC
Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC
Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT
Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA
Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT
Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC
Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren’s syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Play Video

Cite This Article
Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

View Video