Dreidimensionales, serumfreies Kultursystem für Tränendrüsenstammzellen
Summary
Die dreidimensionale, serumfreie Kulturmethode für adulte Tränendrüsenstammzellen (LG) ist für die Induktion der Bildung und Differenzierung von LG-Organoiden in Acinare oder duktale Zellen gut etabliert.
Abstract
Die auf Tränendrüsen (LG) basierende Therapie ist eine vielversprechende Strategie für Tränendrüsenerkrankungen. Das Fehlen einer zuverlässigen, serumfreien Kulturmethode, um eine ausreichende Anzahl von LG-Stammzellen (LGSCs) zu erhalten, ist jedoch ein Hindernis für die weitere Forschung und Anwendung. Die dreidimensionale (3D), serumfreie Kulturmethode für erwachsene Maus-LGSCs ist hier gut etabliert und gezeigt. Die LGSCs könnten kontinuierlich durchgangen und dazu gebracht werden, sich zu Acinare oder duktalen Zellen zu differenzieren.
Für die LGSC-Primärkultur wurden die LGs von 6-8 Wochen alten Mäusen mit Dispase, Kollagenase I und Trypsin-EDTA verdaut. Insgesamt 1 × 104 Einzelzellen wurden in 80 μL Matrix-Gel-Tränendrüsen-Stammzell-Medium-Matrix (LGSCM) in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte gesät, die mit 20 μL Matrix-Gel-LGSCM-Matrix vorbeschichtet war. Die Mischung wurde nach der Inkubation für 20 min bei 37 °C erstarrt und 600 μL LGSCM zugegeben.
Für die LGSC-Wartung wurden LGSCs, die 7 Tage lang kultiviert wurden, durch Dispase und Trypsin-EDTA in einzelne Zellen disaggregiert. Die einzelnen Zellen wurden nach der in der LGSC-Primärkultur verwendeten Methode implantiert und kultiviert. LGSCs konnten über 40 Mal durchgangen werden und kontinuierlich die Stamm- / Vorläuferzellmarker Krt14, Krt5, P63 und Nestin exprimieren. LGSCs, die in LGSCM kultiviert werden, haben eine Selbsterneuerungskapazität und können sich in vitro und in vivo in Acinare oder duktale Zellen differenzieren.
Introduction
Tränendrüsenstammzellen (LGSCs) erhalten die Zellerneuerung der Tränendrüse (LG) und sind die Quelle von Acin- und duktalen Zellen. Daher gilt die LGSC-Transplantation als alternativer Ansatz zur Behandlung schwerer entzündlicher Schäden und einer wässrig-defizienten Erkrankung des trockenen Auges (ADDED)1,2,3. Mehrere Kulturmethoden wurden angewendet, um LGSCs anzureichern. Tiwari et al. trennten und kultivierten primäre LG-Zellen mit Kollagen I und Matrixgel, ergänzt mit mehreren Wachstumsfaktoren; Die LG-Zellen konnten jedoch nicht kontinuierlich kultiviert werden4. Unter Verwendung einer zweidimensionalen (2D) Kultur wurden von der Maus LG-abgeleitete Stammzellen von You et al.5 und Ackermann et al. isoliert. 6, die die Stamm- / Vorläuferzellmarkergene Oct4, Sox2, Nanog und Nestin exprimieren und subkultiviert werden könnten. Es gibt jedoch keinen eindeutigen Hinweis darauf, dass sich diese Zellen in Acinare oder duktale Zellen differenzieren können, und es gibt kein Transplantationsexperiment, um das Differenzierungspotenzial in vivo zu überprüfen.
Kürzlich wurden c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45-Zellen durch Durchflusszytometrie von Maus-LGs isoliert, es wurde festgestellt, dass sie LG-Vorläuferzellmarker wie Pax6 und Runx1 exprimieren und in vitro in Kanäle und Acini differenzieren. Bei Mäusen mit ADDED konnte die orthotope Injektion mit diesen Zellen beschädigte LGs reparieren und die sekretorische Funktion von LGs2 wiederherstellen. Die Anzahl der mit dieser Methode isolierten Stammzellen war jedoch gering, und es gibt keine geeigneten Kulturbedingungen für die Expansion der isolierten LGSCs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein geeignetes Kultursystem eingerichtet werden muss, um erwachsene LGSCs mit stabiler und kontinuierlicher Expansion für die Untersuchung von LGSCs bei der Behandlung von ADDED effektiv zu isolieren und zu kultivieren.
Organoide, die aus Stammzellen oder pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, sind eine Gruppe von Zellen, die den verwandten Organen histologisch ähnlich sind und ihre eigene Erneuerung aufrechterhalten können. Nachdem das Darmorganoid der Maus 20097 erfolgreich von Sato et al. kultiviert wurde, wurden Organoide aus anderen Organen nacheinander kultiviert, basierend auf Satos Kultursystem, wie z.B. Gallenblase8, Leber9, Bauchspeicheldrüse 10, Magen 11, Brust12, Lunge 13, Prostata 14 und Speicheldrüse 15 . Aufgrund des hohen Anteils an adulten Stammzellen vor der Zelldifferenzierung in Organoidkultur gilt die dreidimensionale (3D) Organoidkulturmethode als optimal für die Isolierung und Kultur adulter Stammzellen von LG.
Ein LGSC-Kultursystem für erwachsene Mäuse wurde in der vorliegenden Studie durch Optimierung der 3D-, serumfreien Kulturmethode etabliert. Es ist erwiesen, dass die LGSCs, die sowohl von normalen als auch von ADDED-Mäusen kultiviert wurden, eine stabile Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Proliferation zeigten. Nach der Transplantation in die ADDED-Maus-LGs kolonisierten LGSCs die beeinträchtigten LGs und verbesserten die Tränenproduktion. Darüber hinaus wurden rot fluoreszierende LGSCs aus ROSA26mT/mG-Mäusen isoliert und kultiviert. Diese Arbeit bietet eine zuverlässige Referenz für die LGSC-Anreicherung in vitro und LGSC-Autotransplantat in der klinischen Anwendung für die ADDED-Therapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt etablierte Methoden zur Isolierung und In-vitro-Kultur von Tränenstammzellen für die Tränenstammzellkultur und die LG-Verletzungsreparatur. Shatos et al.17 und Ackermannet al. 6 erfolgreich kultivierte und subkultivierte Tränenstammzellen von Ratten und Mäusen durch 2D-Kulturmethoden, wodurch es möglich ist, Tränenstammzellen für die Behandlung von ADDED zu transplantieren. Studien an Stammzellen18 und mesenchymalen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31871413) und zwei Programme von Guangdong Science and Technology (2017B020230002 und 2016B030231001) unterstützt. Wir sind den Forschern, die uns während der Studie geholfen haben, und den Mitarbeitern des Tierzentrums für ihre Unterstützung bei der Tierpflege wirklich dankbar.
Materials
| Animal(Mouse) | |||
| Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
| NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| Equipment | |||
| Analytical balance | Sartorius | ||
| Automatic dehydrator | Thermo | ||
| Blood counting chamber | BLAU | ||
| Cell Counter | CountStar | ||
| CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
| ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
| Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
| Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
| Frozen tissue slicer | Lecia | ||
| Horizontal centrifuge | CENCE | ||
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
| Liquid nitrogen container | Thermo | ||
| Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Microwave oven | Panasonic | ||
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
| Paraffin slicing machine | Thermo | ||
| PCR Amplifier | Eppendorf | ||
| pH value tester | Sartorius | ||
| 4 °C Refrigerator | Haier | ||
| Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
| Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
| -80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| -20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| Ultra pure water purification system | ELGA | ||
| Reagent | |||
| Animal Experiment | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
| Cell Culture | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE staining & Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
| Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
| Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
| Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
| Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
| Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
| Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
| Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
| Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
| Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | – | |
| Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction & Cell Transfection | |||
| Agar | OXID | – | |
| Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
| LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
| Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID | – | |
| Yeast Extract | OXID | – | |
| Primers and Sequence | Company | ||
| Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |
References
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