Bu protokoller, kullanıcıların Denizatı hücre dışı akı analizini kullanarak 3D kanser hücre hattı kaynaklı sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasını araştırmalarına yardımcı olacaktır.
Sferoidler olarak adlandırılan üç boyutlu (3D) hücresel agregalar, son yıllarda in vitro hücre kültürünün ön saflarında yer almaktadır. Hücreleri iki boyutlu, tek hücreli tek katmanlı (2D kültür) olarak kültürlemenin aksine, küresel hücre kültürü, hücre dışı matris proteinlerinin ekspresyonu, hücre sinyalizasyonu, gen ekspresyonu, protein üretimi, farklılaşma ve proliferasyon dahil olmak üzere in vivo olarak var olan fizyolojik hücresel mimariyi ve özellikleri teşvik eder, düzenler ve destekler. 3D kültürün önemi, onkoloji, diyabet, kök hücre biyolojisi ve doku mühendisliği dahil olmak üzere birçok araştırma alanında kabul edilmiştir. Son on yılda, sferoidler üretmek ve metabolik işlevlerini ve kaderlerini değerlendirmek için geliştirilmiş yöntemler geliştirilmiştir.
Hücre dışı akı (XF) analizörleri, bir XF24 adacık yakalama plakası veya bir XFe96 küresel mikroplaka kullanarak sferoidler gibi 3D mikro dokularda mitokondriyal fonksiyonu keşfetmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, farklı protokoller ve XF teknolojisini kullanarak sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasının araştırılmasının optimizasyonu ayrıntılı olarak tanımlanmamıştır. Bu yazıda, XFe96 XF analizörü ile küresel mikroplakalar kullanılarak tek bir 3D sferoidde mitokondriyal enerji metabolizmasının araştırılması için ayrıntılı protokoller sunulmaktadır. Farklı kanser hücre hatları kullanarak, XF teknolojisinin sadece farklı boyutlarda değil, aynı zamanda farklı hacimlerde, hücre sayılarında, DNA içeriğinde ve tipinde 3D sferoidlerde hücresel solunum arasında ayrım yapabildiği gösterilmiştir.
Oligomisin, BAM15, rotenon ve antimisin A’nın optimal mitokondriyal efektör bileşik konsantrasyonları, 3D sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasının spesifik parametrelerini araştırmak için kullanılır. Bu yazıda ayrıca sferoidlerden elde edilen verileri normalleştirme yöntemleri tartışılmakta ve XF teknolojisini kullanarak küresel metabolizmayı keşfederken göz önünde bulundurulması gereken birçok husus ele alınmaktadır. Bu protokol, gelişmiş in vitro sferoid modellerde araştırma yapılmasına yardımcı olacaktır.
Biyolojik araştırmalarda in vitro modellerdeki ilerlemeler son 20 yılda hızla ilerlemiştir. Bu tür modeller artık çip üzerinde organ modalitelerini, organoidleri ve 3D mikrodoku sferoidlerini içeriyor ve bunların hepsi in vitro ve in vivo çalışmalar arasındaki çeviriyi geliştirmek için ortak bir odak noktası haline geldi. Gelişmiş in vitro modellerin, özellikle de sferoidlerin kullanımı, doku mühendisliği, kök hücre araştırması, kanser ve hastalık biyolojisi 1,2,3,4,5,6,7 ve genetik toksikoloji 8,9,10, nanomalzemeler toksikolojisi 11 dahil olmak üzere güvenlik testleri dahil olmak üzere çeşitli araştırma alanlarını kapsamaktadır. 12,13,14 ve ilaç güvenliği ve etkinliği testi8,15,16,17,18,19.
Normal hücre morfolojisi biyolojik fenotip ve aktivite için kritik öneme sahiptir. Hücreleri 3D mikrodoku sferoidlerine kültürlemek, hücrelerin in vivo olarak gözlemlenene daha çok benzeyen ancak klasik tek katmanlı hücre kültürü teknikleriyle yakalanması zor olan bir morfoloji, fenotipik fonksiyon ve mimari benimsemelerini sağlar. Hem in vivo hem de in vitro , hücresel fonksiyon, hücresel iletişim ve programlama ile sınırlı olmayan hücresel mikro çevreden doğrudan etkilenir (örneğin, hücre-hücre birleşme oluşumları, hücre nişleri oluşturma fırsatları); yakın çevrelerde hormonlara ve büyüme faktörlerine hücre maruziyeti (örneğin, enflamatuar yanıtın bir parçası olarak hücresel sitokin maruziyeti); fiziksel ve kimyasal matrislerin bileşimi (örneğin, hücrelerin sert doku kültürü plastiğinde mi yoksa elastik bir doku ortamında mı yetiştirildiği); ve en önemlisi, hücresel metabolizmanın beslenme ve oksijene erişimin yanı sıra laktik asit gibi metabolik atık ürünlerin işlenmesinden nasıl etkilendiği.
Metabolik akı analizi, tanımlanmış in vitro sistemlerdeki hücresel metabolizmayı incelemenin güçlü bir yoludur. Spesifik olarak, XF teknolojisi, bozulmamış hücrelerin ve dokuların hücresel biyoenerjetik özelliklerindeki canlı, gerçek zamanlı değişikliklerin analizine izin verir. Birçok hücre içi metabolik olayın saniyeler ila dakikalar arasında meydana geldiği göz önüne alındığında, gerçek zamanlı fonksiyonel yaklaşımlar, bozulmamış hücrelerde ve dokularda in vitro hücresel metabolik akıdaki gerçek zamanlı değişiklikleri anlamak için çok önemlidir.
Bu yazıda kanserden türetilmiş hücre hatları A549 (akciğer adenokarsinomu), HepG2/C3A (hepatosellüler karsinom), MCF-7 (meme adenokarsinomu) ve SK-OV-3 (over adenokarsinomu) hücre hatlarının in vitro 3D sferoid modeller kullanılarak zorla agregasyon yaklaşımları kullanılarak geliştirilmesi için protokoller sunulmaktadır (Şekil 1). Ayrıca, (i) Agilent XFe96 XF analizörü kullanılarak tek 3D sferoidlerin mitokondriyal enerji metabolizmasının nasıl araştırılacağını ayrıntılı olarak açıklar, (ii) tek 3D sferoidleri kullanarak XF analizlerini optimize etmenin yollarını vurgular ve (iii) bu yaklaşımı kullanarak 3D sferoid metabolizmasını araştırmanın önemli hususlarını ve sınırlamalarını tartışır. En önemlisi, bu makalede, hücresel sferoidlerde oksidatif fosforilasyonu ve dolayısıyla mitokondriyal fonksiyonu belirlemek için oksijen tüketim hızının (OCR) hesaplanmasına izin veren veri kümelerinin nasıl toplandığı açıklanmaktadır. Bu protokol için analiz edilmemiş olsa da, hücre dışı asitleşme hızı (ECAR), XF deneylerinde OCR verileriyle birlikte ölçülen başka bir parametredir. Bununla birlikte, ECAR genellikle XF veri kümelerinden kötü veya yanlış yorumlanır. Teknoloji üreticisinin temel yaklaşımlarını izleyerek ECAR’ı hesaplamanın sınırlamaları hakkında bir yorum sunuyoruz.
Ana bulgular ve çıktılar
Bu makale, XFe96 XF Analyzer ile bir dizi kanser kaynaklı hücre hattı kullanarak tek 3D sferoidlerin mitokondriyal enerji metabolizmasını araştırmak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Zorla toplama için hücre kovucu teknolojiler kullanılarak A549, HepG2 / C3A, MCF7 ve SK-OV-3 hücresel sferoidlerin hızlı bir şekilde yetiştirilmesi için bir yöntem geliştirilmiş ve tanımlanmıştır. Bu protokol, (1) küresel kültür protokollerinin optimizasyon…
The authors have nothing to disclose.
N.J.C, Sygnature Discovery Ltd ile BBSRC MIBTP CASE Award tarafından desteklenmiştir (BB/M01116X/1, 1940003)
A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |