Questi protocolli aiuteranno gli utenti a sondare il metabolismo energetico mitocondriale negli sferoidi derivati dalla linea cellulare del cancro 3D utilizzando l’analisi del flusso extracellulare di Cavalluccio marino.
Gli aggregati cellulari tridimensionali (3D), chiamati sferoidi, sono diventati l’avanguardia della coltura cellulare in vitro negli ultimi anni. A differenza della coltura delle cellule come monostrati bidimensionali a singola cellula (coltura 2D), la coltura cellulare sferoide promuove, regola e supporta l’architettura cellulare fisiologica e le caratteristiche che esistono in vivo, compresa l’espressione di proteine della matrice extracellulare, la segnalazione cellulare, l’espressione genica, la produzione di proteine, la differenziazione e la proliferazione. L’importanza della cultura 3D è stata riconosciuta in molti campi di ricerca, tra cui oncologia, diabete, biologia delle cellule staminali e ingegneria tissutale. Nell’ultimo decennio, sono stati sviluppati metodi migliorati per produrre sferoidi e valutare la loro funzione metabolica e il loro destino.
Gli analizzatori di flusso extracellulare (XF) sono stati utilizzati per esplorare la funzione mitocondriale in microtessuti 3D come gli sferoidi utilizzando una piastra di cattura delle isole XF24 o una micropiastra sferoide XFe96. Tuttavia, protocolli distinti e l’ottimizzazione del metabolismo energetico mitocondriale di sonda negli sferoidi utilizzando la tecnologia XF non sono stati descritti in dettaglio. Questo documento fornisce protocolli dettagliati per sondare il metabolismo energetico mitocondriale in singoli sferoidi 3D utilizzando micropiastre sferoidi con l’analizzatore XF XFe96. Utilizzando diverse linee cellulari tumorali, la tecnologia XF ha dimostrato di essere in grado di distinguere tra respirazione cellulare in sferoidi 3D non solo di diverse dimensioni, ma anche di diversi volumi, numeri di cellule, contenuto e tipo di DNA.
Le concentrazioni ottimali di composti effettori mitocondriali di oligomicina, BAM15, rotenone e antimicina A vengono utilizzate per sondare parametri specifici del metabolismo energetico mitocondriale negli sferoidi 3D. Questo documento discute anche i metodi per normalizzare i dati ottenuti dagli sferoidi e affronta molte considerazioni che dovrebbero essere prese in considerazione quando si esplora il metabolismo sferoide utilizzando la tecnologia XF. Questo protocollo aiuterà a guidare la ricerca in modelli sferoidi avanzati in vitro .
I progressi nei modelli in vitro nella ricerca biologica sono progrediti rapidamente negli ultimi 20 anni. Tali modelli ora includono modalità organ-on-a-chip, organoidi e sferoidi microtesssuei 3D, che sono diventati tutti un obiettivo comune per migliorare la traduzione tra studi in vitro e in vivo. L’uso di modelli avanzati in vitro, in particolare sferoidi, abbraccia diversi campi di ricerca, tra cui l’ingegneria tissutale, la ricerca sulle cellule staminali, il cancro e la biologia delle malattie 1,2,3,4,5,6,7 e i test di sicurezza, tra cui la tossicologia genetica 8,9,10, la tossicologia dei nanomateriali11, 12,13,14 e test di sicurezza ed efficacia dei farmaci 8,15,16,17,18,19.
La normale morfologia cellulare è fondamentale per il fenotipo e l’attività biologica. La coltivazione di cellule in sferoidi microtissuei 3D consente alle cellule di adottare una morfologia, una funzione fenotipica e un’architettura, più simile a quella osservata in vivo ma difficile da catturare con le classiche tecniche di coltura cellulare monostrato. Sia in vivo che in vitro, la funzione cellulare è direttamente influenzata dal microambiente cellulare, che non si limita alla comunicazione e alla programmazione cellulare (ad esempio, formazioni di giunzione cellula-cellula, opportunità di formare nicchie cellulari); esposizione cellulare agli ormoni e ai fattori di crescita negli ambienti immediati (ad esempio, esposizione cellulare alle citochine come parte di una risposta infiammatoria); composizione di matrici fisiche e chimiche (ad esempio, se le cellule vengono coltivate in plastica di coltura tissutale rigida o in un ambiente di tessuto elastico); e, soprattutto, come il metabolismo cellulare è influenzato dalla nutrizione e dall’accesso all’ossigeno, nonché dalla lavorazione di prodotti di scarto metabolici come l’acido lattico.
L’analisi del flusso metabolico è un modo potente per esaminare il metabolismo cellulare all’interno di sistemi in vitro definiti. In particolare, la tecnologia XF consente l’analisi di cambiamenti vivi e in tempo reale nella bioenergetica cellulare di cellule e tessuti intatti. Dato che molti eventi metabolici intracellulari si verificano nell’ordine di secondi o minuti, gli approcci funzionali in tempo reale sono fondamentali per comprendere i cambiamenti in tempo reale nel flusso metabolico cellulare in cellule e tessuti intatti in vitro.
Questo documento fornisce protocolli per la coltivazione di linee cellulari derivate dal cancro A549 (adenocarcinoma polmonare), HepG2 / C3A (carcinoma epatocellulare), MCF-7 (adenocarcinoma mammario) e SK-OV-3 (adenocarcinoma ovarico) come modelli sferoidi 3D in vitro utilizzando approcci ad aggregazione forzata (Figura 1). Inoltre (i) descrive in dettaglio come sondare il metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi 3D utilizzando l’analizzatore Agilent XFe96 XF, (ii) evidenzia i modi per ottimizzare i saggi XF utilizzando singoli sferoidi 3D e (iii) discute importanti considerazioni e limitazioni del sondaggio del metabolismo sferoide 3D utilizzando questo approccio. Ancora più importante, questo documento descrive come vengono raccolti i set di dati che consentono il calcolo del tasso di consumo di ossigeno (OCR) per determinare la fosforilazione ossidativa e quindi la funzione mitocondriale negli sferoidi cellulari. Sebbene non sia stato analizzato per questo protocollo, il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) è un altro parametro che viene misurato insieme ai dati OCR negli esperimenti XF. Tuttavia, ECAR è spesso interpretato in modo errato o errato dai set di dati XF. Forniamo un commento sui limiti del calcolo dell’ECAR seguendo gli approcci di base del produttore della tecnologia.
Principali risultati e realizzazioni
Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per sondare il metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi 3D utilizzando una serie di linee cellulari derivate dal cancro con l’analizzatore XF XFe96. Viene sviluppato e descritto un metodo per la rapida coltivazione di sferoidi cellulari A549, HepG2/C3A, MCF7 e SK-OV-3 utilizzando tecnologie cellorepellenti per l’aggregazione forzata. Questo protocollo affronta molte considerazioni sulla sonda del m…
The authors have nothing to disclose.
N.J.C è stato supportato da un BBSRC MIBTP CASE Award con Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)
A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |