Esses protocolos ajudarão os usuários a sondar o metabolismo de energia mitocondrial em esferoides derivados de células cancerígenas 3D usando a análise de fluxo extracelular do Seahorse.
Agregados celulares tridimensionais (3D), denominados esferoides, tornaram-se a vanguarda da cultura celular in vitro nos últimos anos. Em contraste com as células cultivadas como monocamadas bidimensionais e unicelulares (cultura 2D), a cultura celular esfóide promove, regula e suporta arquitetura fisiológica celular e características que existem in vivo, incluindo a expressão de proteínas de matriz extracelular, sinalização celular, expressão genética, produção de proteínas, diferenciação e proliferação. A importância da cultura 3D tem sido reconhecida em muitas áreas de pesquisa, incluindo oncologia, diabetes, biologia de células-tronco e engenharia de tecidos. Na última década, métodos aprimorados foram desenvolvidos para produzir esferoides e avaliar sua função metabólica e destino.
Analisadores de fluxo extracelular (XF) têm sido usados para explorar a função mitocondrial em microtissues 3D, como esferoides usando uma placa de captura de ilhotas XF24 ou uma microplaca esferoide XFe96. No entanto, protocolos distintos e a otimização da sondagem do metabolismo de energia mitocondrial em esferoides usando a tecnologia XF não foram descritos em detalhes. Este artigo fornece protocolos detalhados para sondar o metabolismo de energia mitocondrial em esferoides 3D únicos usando microplapes esferoides com o analisador XFe96 XF. Usando diferentes linhas de células cancerígenas, a tecnologia XF é demonstrada ser capaz de distinguir entre a respiração celular em esferoides 3D não apenas de tamanhos diferentes, mas também diferentes volumes, números celulares, conteúdo de DNA e tipo.
As concentrações compostas de efeito mitocondrial ideal de oligomicina, BAM15, rotenona e antimicina A são usadas para sondar parâmetros específicos do metabolismo de energia mitocondrial em esferoides 3D. Este artigo também discute métodos para normalizar dados obtidos a partir de esferoides e aborda muitas considerações que devem ser consideradas ao explorar o metabolismo esferoide usando a tecnologia XF. Este protocolo ajudará a impulsionar a pesquisa em modelos esferoides in vitro avançados.
Os avanços em modelos in vitro em pesquisa biológica progrediram rapidamente nos últimos 20 anos. Tais modelos agora incluem modalidades organ-on-a-chip, organoides e esferoides microtissue 3D, todos os quais se tornaram um foco comum para melhorar a tradução entre estudos in vitro e in vivo. O uso de modelos in vitro avançados, particularmente esferoides, abrange diversos campos de pesquisa, incluindo engenharia de tecidos, pesquisa de células-tronco, câncer e biologia de doenças 1,2,3,4,5,6,7, e testes de segurança, incluindo toxicologia genética 8,9,10, toxicologia de nanomateriais11, 12,13,14, e testes de segurança e eficácia de medicamentos 8,15,16,17,18,19.
A morfologia celular normal é fundamental para o fenótipo biológico e a atividade. A colheita de células em esferoides microtissue 3D permite que as células adotem uma morfologia, função fenotípica e arquitetura, mais semelhantes às observadas in vivo , mas difíceis de capturar com técnicas clássicas de cultura celular monocamada. Tanto in vivo quanto in vitro, a função celular é diretamente impactada pelo microambiente celular, que não se limita à comunicação e programação celular (por exemplo, formações de junção celular-célula, oportunidades de formação de nichos celulares); exposição celular a hormônios e fatores de crescimento nos ambientes imediatos (por exemplo, exposição à citocina celular como parte de uma resposta inflamatória); composição de matrizes físicas e químicas (por exemplo, se as células são cultivadas em plástico de cultura tecidual rígida ou um ambiente de tecido elástico); e, mais importante, como o metabolismo celular é impactado pela nutrição e acesso ao oxigênio, bem como pelo processamento de resíduos metabólicos, como o ácido láctico.
A análise do fluxo metabólico é uma maneira poderosa de examinar o metabolismo celular dentro de sistemas in vitro definidos. Especificamente, a tecnologia XF permite a análise de mudanças ao vivo e em tempo real nos bioenergésicos celulares de células e tecidos intactos. Dado que muitos eventos metabólicos intracelulares ocorrem dentro da ordem de segundos a minutos, abordagens funcionais em tempo real são primordiais para entender mudanças em tempo real no fluxo metabólico celular em células intactas e tecidos in vitro.
Este artigo fornece protocolos para o cultivo das linhas celulares derivadas do câncer A549 (adenocarcinoma pulmonar), HepG2/C3A (carcinoma hepatocelular), MCF-7 (adenocarcinoma mamário) e SK-OV-3 (adenocarcinoma ovariano) como modelos esferoides in vitro 3D usando abordagens de agregação forçada (Figura 1). Ele também (i) descreve em detalhes como sondar o metabolismo de energia mitocondrial de esferoides 3D únicos usando o analisador Agilent XFe96 XF, (ii) destaca maneiras de otimizar os ensaios XF usando spheroids 3D únicos, e (iii) discute considerações e limitações importantes de sondagem do metabolismo esferoide 3D usando essa abordagem. Mais importante, este artigo descreve como são coletados conjuntos de dados que permitem o cálculo da taxa de consumo de oxigênio (OCR) para determinar a fosforilação oxidativa e, portanto, a função mitocondrial em esferoides celulares. Embora não seja analisada para este protocolo, a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é outro parâmetro que é medido ao lado de dados OCR em experimentos XF. No entanto, o ECAR é muitas vezes mal ou incorretamente interpretado a partir de conjuntos de dados XF. Nós fornecemos um comentário sobre as limitações de cálculo do ECAR seguindo abordagens básicas do fabricante de tecnologia.
Principais descobertas e saídas
Este artigo fornece um protocolo detalhado para sondar o metabolismo de energia mitocondrial de esferoides 3D únicos usando uma série de linhas celulares derivadas do câncer com o XFe96 XF Analyzer. Um método é desenvolvido e descrito para o rápido cultivo de Esferoides celulares A549, HepG2/C3A, MCF7 e SK-OV-3 usando tecnologias repelentes celulares para agregação forçada. Este protocolo aborda muitas considerações sobre a sondagem do metabolismo esferoide …
The authors have nothing to disclose.
N.J.C foi apoiado por um Prêmio BBSRC MIBTP CASE com a Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)
A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |