Эти протоколы помогут пользователям исследовать энергетический метаболизм митохондрий в 3D-сфероидах, полученных из клеточных линий рака, с использованием анализа внеклеточного потока Seahorse.
Трехмерные (3D) клеточные агрегаты, называемые сфероидами, стали авангардом клеточной культуры in vitro в последние годы. В отличие от культивирования клеток в виде двумерных одноклеточных монослоев (2D-культура), сфероидная клеточная культура способствует, регулирует и поддерживает физиологическую клеточную архитектуру и характеристики, которые существуют in vivo, включая экспрессию белков внеклеточного матрикса, клеточную сигнализацию, экспрессию генов, производство белка, дифференцировку и пролиферацию. Важность 3D-культуры была признана во многих областях исследований, включая онкологию, диабет, биологию стволовых клеток и тканевую инженерию. За последнее десятилетие были разработаны усовершенствованные методы получения сфероидов и оценки их метаболической функции и судьбы.
Анализаторы внеклеточного потока (XF) использовались для изучения митохондриальной функции в 3D-микротизюсах, таких как сфероиды, с использованием либо пластины захвата островков XF24, либо сфероидной микропластины XFe96. Однако отдельные протоколы и оптимизация зондирования митохондриального энергетического обмена у сфероидов с использованием технологии XF подробно не описаны. В данной статье представлены подробные протоколы зондирования митохондриального энергетического обмена в одиночных 3D-сфероидах с использованием сфероидных микропластин с анализатором XFe96 XF. Используя различные линии раковых клеток, технология XF способна различать клеточное дыхание в 3D-сфероидах не только разных размеров, но и разных объемов, количества клеток, содержания и типа ДНК.
Оптимальные концентрации митохондриальных эффекторных соединений олигомицина, БАМ15, ротенона и антимицина А используются для исследования специфических параметров митохондриального энергетического метаболизма в 3D-сфероидах. В этой статье также обсуждаются методы нормализации данных, полученных от сфероидов, и рассматриваются многие соображения, которые следует учитывать при изучении сфероидного метаболизма с использованием технологии XF. Этот протокол поможет стимулировать исследования в передовых сфероидных моделях in vitro .
Достижения в области моделей in vitro в биологических исследованиях быстро прогрессировали за последние 20 лет. Такие модели теперь включают модальности «орган на чипе», органоиды и 3D-сфероиды микротизю, все из которых стали общим фокусом для улучшения трансляции между исследованиями in vitro и in vivo. Использование передовых моделей in vitro, особенно сфероидов, охватывает несколько областей исследований, включая тканевую инженерию, исследования стволовых клеток, рак и биологию заболеваний 1,2,3,4,5,6,7, и тестирование безопасности, включая генетическую токсикологию 8,9,10, токсикологию наноматериалов11, 12,13,14, и тестирование безопасности и эффективности лекарств 8,15,16,17,18,19.
Нормальная морфология клеток имеет решающее значение для биологического фенотипа и активности. Культивирование клеток в 3D-сфероиды микротизуса позволяет клеткам принимать морфологию, фенотипическую функцию и архитектуру, более похожую на ту, что наблюдается in vivo , но ее трудно захватить с помощью классических методов монослойной клеточной культуры. Как in vivo , так и in vitro клеточная функция напрямую зависит от клеточной микросреды, которая не ограничивается клеточной связью и программированием (например, образования клеточно-клеточных переходов, возможности формирования клеточных ниш); воздействие на клетки гормонов и факторов роста в непосредственной среде (например, воздействие клеточных цитокинов как часть воспалительной реакции); состав физических и химических матриц (например, выращиваются ли клетки в пластической культуре жесткой ткани или в эластичной тканевой среде); и, самое главное, как на клеточный метаболизм влияют питание и доступ к кислороду, а также переработка метаболических отходов, таких как молочная кислота.
Анализ метаболических потоков является мощным способом изучения клеточного метаболизма в определенных системах in vitro . В частности, технология XF позволяет анализировать живые изменения в клеточной биоэнергетике интактных клеток и тканей в режиме реального времени. Учитывая, что многие внутриклеточные метаболические события происходят в течение порядка секунд до минут, функциональные подходы в реальном времени имеют первостепенное значение для понимания изменений клеточного метаболического потока в реальном времени в неповрежденных клетках и тканях in vitro.
В данной статье представлены протоколы культивирования раковых клеточных линий A549 (аденокарцинома легких), HepG2/C3A (гепатоцеллюлярная карцинома), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы) и SK-OV-3 (аденокарцинома яичников) в виде 3D-сфероидных моделей in vitro с использованием подходов принудительной агрегации (рисунок 1). В нем также (i) подробно описывается, как исследовать митохондриальный энергетический метаболизм одиночных 3D-сфероидов с помощью анализатора Agilent XFe96 XF, (ii) выделяются способы оптимизации анализов XF с использованием одиночных 3D-сфероидов и (iii) обсуждаются важные соображения и ограничения зондирования метаболизма 3D-сфероидов с использованием этого подхода. Самое главное, в этой статье описывается, как собираются наборы данных, которые позволяют рассчитать скорость потребления кислорода (OCR) для определения окислительного фосфорилирования и, следовательно, митохондриальной функции в клеточных сфероидах. Хотя это не анализируется для этого протокола, скорость внеклеточного подкисления (ECAR) является еще одним параметром, который измеряется вместе с данными OCR в экспериментах XF. Однако ECAR часто плохо или неправильно интерпретируется из наборов данных XF. Мы предоставляем комментарий относительно ограничений расчета ECAR в соответствии с основными подходами производителя технологии.
Основные выводы и результаты
В этой статье представлен подробный протокол для исследования митохондриального энергетического метаболизма отдельных 3D-сфероидов с использованием серии клеточных линий, полученных из рака, с помощью анализатора XFe96 XF. Разработан и описан спос…
The authors have nothing to disclose.
N.J.C был поддержан премией BBSRC MIBTP CASE Award с Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)
A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |