פרוטוקולים אלה יסייעו למשתמשים לחקור את חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים שמקורם בתאי סרטן תלת-ממדיים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי של סוסון ים.
אגרגטים תאיים תלת-ממדיים (3D), המכונים ספרואידים, הפכו בשנים האחרונות לחזית תרבית התאים במבחנה . בניגוד לתאי התרבות כחד-שכבתיים דו-ממדיים חד-תאיים (תרבית דו-ממדית), תרבית תאים כדורית מקדמת, מווסתת ותומכת בארכיטקטורה תאית פיזיולוגית ובמאפיינים הקיימים ב-vivo, כולל ביטוי של חלבוני מטריצה חוץ-תאית, איתות תאים, ביטוי גנים, ייצור חלבונים, התמיינות והתפשטות. חשיבותה של תרבית תלת-ממדית הוכרה בתחומי מחקר רבים, כולל אונקולוגיה, סוכרת, ביולוגיה של תאי גזע והנדסת רקמות. בעשור האחרון פותחו שיטות משופרות לייצור ספרואידים ולהערכת תפקודם המטבולי וגורלם.
מנתחי שטף חוץ-תאי (XF) שימשו כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה במיקרוטיסים תלת-ממדיים כגון ספרואידים באמצעות צלחת לכידת איים XF24 או מיקרו-פלטה ספרואידית XFe96. עם זאת, פרוטוקולים ברורים ואופטימיזציה של בדיקת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים באמצעות טכנולוגיית XF לא תוארו בפירוט. מאמר זה מספק פרוטוקולים מפורטים לבדיקת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים תלת-ממדיים בודדים באמצעות מיקרו-פלטות ספרואידיות עם מנתח XF XFe96. באמצעות קווי תאים סרטניים שונים, טכנולוגיית XF מוכחת כמי שמסוגלת להבחין בין נשימה תאית בספרואידים תלת-ממדיים בגדלים שונים לא רק בגדלים שונים, אלא גם בנפחים שונים, מספרי תאים, תכולת DNA וסוגים שונים.
ריכוזי התרכובת האופטימליים של אוליגומיצין, BAM15, רוטנון ואנטימיצין A משמשים לבדיקת פרמטרים ספציפיים של חילוף חומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים תלת-ממדיים. מאמר זה דן גם בשיטות לנרמול נתונים המתקבלים מספרואידים ומתייחס לשיקולים רבים שיש לקחת בחשבון בעת חקירת חילוף החומרים של הספרואידים באמצעות טכנולוגיית XF. פרוטוקול זה יסייע להניע מחקר במודלים מתקדמים של ספרואידים במבחנה .
ההתקדמות במודלים חוץ גופיים במחקר הביולוגי התקדמה במהירות במהלך 20 השנים האחרונות. מודלים כאלה כוללים כיום אופנות של איברים על שבב, אורגנואידים וספרואידים תלת-ממדיים של מיקרוטיסואה, שכולם הפכו למוקד נפוץ לשיפור התרגום בין מחקרי in vitro ו-in vivo. השימוש במודלים מתקדמים במבחנה, במיוחד ספרואידים, משתרע על פני מספר תחומי מחקר, כולל הנדסת רקמות, מחקר בתאי גזע, סרטן וביולוגיה של מחלות 1,2,3,4,5,6,7, ובדיקות בטיחות, כולל טוקסיקולוגיה גנטית 8,9,10, טוקסיקולוגיה של ננו-חומרים11, 12,13,14, ובדיקות בטיחות ויעילות של תרופות 8,15,16,17,18,19.
מורפולוגיה תקינה של תאים היא קריטית לפנוטיפ ולפעילות ביולוגית. גידול תאים לכדי ספרואידים תלת-ממדיים של מיקרוטיסואה מאפשר לתאים לאמץ מורפולוגיה, פונקציה פנוטיפית וארכיטקטורה, הדומים יותר לאלה שנצפו in vivo אך קשים ללכידה באמצעות טכניקות קלאסיות של תרביות תאים חד-שכבתיות יותר. הן in vivo והן in vitro, תפקוד התאים מושפע ישירות מהמיקרו-סביבה התאית, שאינה מוגבלת לתקשורת תאית ותכנות (למשל, תצורות צומת תאים-תאים, הזדמנויות ליצור נישות תאים); חשיפת תאים להורמונים ולגורמי גדילה בסביבות המיידיות (למשל, חשיפה לציטוקין תאי כחלק מתגובה דלקתית); הרכב של מטריצות פיזיקליות וכימיות (למשל, האם תאים גדלים בפלסטיק בתרבית רקמה נוקשה או בסביבת רקמה אלסטית); והכי חשוב, כיצד חילוף החומרים התאי מושפע מתזונה וגישה לחמצן, כמו גם מעיבוד של תוצרי פסולת מטבולית כגון חומצה לקטית.
ניתוח שטף מטבולי הוא דרך רבת עוצמה לבחון את חילוף החומרים התאי בתוך מערכות מוגדרות במבחנה . באופן ספציפי, טכנולוגיית XF מאפשרת ניתוח של שינויים חיים בזמן אמת בביו-אנרגיה תאית של תאים ורקמות שלמים. בהתחשב בכך שאירועים מטבוליים תוך-תאיים רבים מתרחשים בסדר גודל של שניות עד דקות, גישות תפקודיות בזמן אמת הן בעלות חשיבות עליונה להבנת שינויים בזמן אמת בשטף המטבולי התאי בתאים שלמים וברקמות במבחנה.
מאמר זה מספק פרוטוקולים לטיפוח קווי תאים שמקורם בסרטן A549 (אדנוקרצינומה של הריאות), HepG2/C3A (קרצינומה הפטוצלולרית), MCF-7 (אדנוקרצינומה של השד) ו-SK-OV-3 (אדנוקרצינומה שחלתית) כמו במודלים ספרואידיים תלת-ממדיים במבחנה תוך שימוש בגישות של צבירה כפויה (איור 1). הוא גם (i) מתאר בפירוט כיצד לחקור את חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות תלת-ממדיות בודדות באמצעות מנתח Agilent XFe96 XF, (ii) מדגיש דרכים לייעל את מבחני ה-XF באמצעות ספרואידים תלת-ממדיים בודדים, ו-(iii) דן בשיקולים חשובים ובמגבלות של בדיקת חילוף החומרים הספרואידי התלת-ממדי באמצעות גישה זו. והכי חשוב, מאמר זה מתאר כיצד נאספים מערכי נתונים המאפשרים חישוב של קצב צריכת החמצן (OCR) כדי לקבוע זרחון חמצוני ובכך את תפקוד המיטוכונדריה בספרואידים תאיים. למרות שלא נותח עבור פרוטוקול זה, קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) הוא פרמטר נוסף הנמדד לצד נתוני OCR בניסויי XF. עם זאת, ECAR מתפרש לעתים קרובות בצורה גרועה או שגויה ממערכי נתונים של XF. אנו מספקים פרשנות לגבי המגבלות של חישוב ECAR בעקבות גישות בסיסיות של יצרן הטכנולוגיה.
ממצאים ותפוקות עיקריים
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לבדיקת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של ספרואידים תלת-ממדיים בודדים באמצעות סדרה של קווי תאים שמקורם בסרטן עם מנתח XFe96 XF. שיטה מפותחת ומתוארת לטיפוח מהיר של A549, HepG2/C3A, MCF7 ו-SK-OV-3 כדוריים תאיים באמצעות טכנולוגיות דוחות תא…
The authors have nothing to disclose.
N.J.C נתמך על ידי פרס מקרה BBSRC MIBTP עם Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)
A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |