Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse
Summary
Deze protocollen zullen gebruikers helpen bij het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in 3D-kankercellijn-afgeleide sferoïden met behulp van Seahorse extracellulaire fluxanalyse.
Abstract
Driedimensionale (3D) cellulaire aggregaten, sferoïden genoemd, zijn de afgelopen jaren de voorhoede geworden van in vitro celkweek. In tegenstelling tot het kweken van cellen als tweedimensionale, eencellige monolagen (2D-cultuur), bevordert, reguleert en ondersteunt sferoïde celcultuur fysiologische cellulaire architectuur en kenmerken die in vivo bestaan, waaronder de expressie van extracellulaire matrixeiwitten, celsignalering, genexpressie, eiwitproductie, differentiatie en proliferatie. Het belang van 3D-cultuur is erkend in vele onderzoeksgebieden, waaronder oncologie, diabetes, stamcelbiologie en tissue engineering. In het afgelopen decennium zijn verbeterde methoden ontwikkeld om sferoïden te produceren en hun metabole functie en lot te beoordelen.
Extracellulaire flux (XF) analyzers zijn gebruikt om de mitochondriale functie in 3D-microtissues zoals sferoïden te onderzoeken met behulp van een XF24 eilandje capture plate of een XFe96 spheroid microplaat. Verschillende protocollen en de optimalisatie van het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in sferoïden met behulp van XF-technologie zijn echter niet in detail beschreven. Dit artikel biedt gedetailleerde protocollen voor het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in enkele 3D-sferoïden met behulp van sferoïde microplaten met de XFe96 XF-analyzer. Met behulp van verschillende kankercellijnen is aangetoond dat XF-technologie in staat is om onderscheid te maken tussen cellulaire ademhaling in 3D-sferoïden van niet alleen verschillende groottes, maar ook verschillende volumes, celnummers, DNA-inhoud en type.
De optimale mitochondriale effectorverbindingsconcentraties van oligomycine, BAM15, rotenon en antimycine A worden gebruikt om specifieke parameters van mitochondriaal energiemetabolisme in 3D-sferoïden te onderzoeken. Dit artikel bespreekt ook methoden om gegevens verkregen uit sferoïden te normaliseren en behandelt vele overwegingen die moeten worden overwogen bij het verkennen van sferoïdemetabolisme met behulp van XF-technologie. Dit protocol zal helpen bij het stimuleren van onderzoek in geavanceerde in vitro sferoïde modellen.
Introduction
Vooruitgang in in vitro modellen in biologisch onderzoek is de afgelopen 20 jaar snel vooruitgegaan. Dergelijke modellen omvatten nu organ-on-a-chip-modaliteiten, organoïden en 3D-microtissue-sferoïden, die allemaal een gemeenschappelijke focus zijn geworden om de translatie tussen in vitro en in vivo studies te verbeteren. Het gebruik van geavanceerde in vitro modellen, met name sferoïden, omvat verschillende onderzoeksgebieden, waaronder tissue engineering, stamcelonderzoek, kanker en ziektebiologie 1,2,3,4,5,6,7, en veiligheidstests, waaronder genetische toxicologie 8,9,10, nanomaterialen toxicologie11, 12,13,14, en drug veiligheid en werkzaamheid testen 8,15,16,17,18,19.
Normale celmorfologie is van cruciaal belang voor biologisch fenotype en activiteit. Het kweken van cellen tot 3D-microtissue-sferoïden stelt cellen in staat om een morfologie, fenotypische functie en architectuur aan te nemen, meer verwant aan die waargenomen in vivo , maar moeilijk te vangen met klassieke monolayer celkweektechnieken. Zowel in vivo als in vitro wordt de cellulaire functie direct beïnvloed door de cellulaire micro-omgeving, die niet beperkt is tot cellulaire communicatie en programmering (bijv. Cel-cel junctie formaties, mogelijkheden om celniches te vormen); celblootstelling aan hormonen en groeifactoren in de directe omgeving (bijv. cellulaire cytokineblootstelling als onderdeel van een ontstekingsreactie); samenstelling van fysische en chemische matrices (bijvoorbeeld of cellen worden gekweekt in stijf weefselkweekplastic of een elastische weefselomgeving); en vooral, hoe het cellulaire metabolisme wordt beïnvloed door voeding en toegang tot zuurstof, evenals de verwerking van metabole afvalproducten zoals melkzuur.
Metabole fluxanalyse is een krachtige manier om het cellulaire metabolisme binnen gedefinieerde in vitro systemen te onderzoeken. In het bijzonder maakt XF-technologie de analyse mogelijk van levende, real-time veranderingen in cellulaire bio-energetica van intacte cellen en weefsels. Gezien het feit dat veel intracellulaire metabole gebeurtenissen plaatsvinden binnen de orde van seconden tot minuten, zijn real-time functionele benaderingen van het grootste belang voor het begrijpen van real-time veranderingen in cellulaire metabole flux in intacte cellen en weefsels in vitro.
Dit artikel bevat protocollen voor het cultiveren van van kanker afgeleide cellijnen A549 (longadenocarcinoom), HepG2 / C3A (hepatocellulair carcinoom), MCF-7 (borstadenocarcinoom) en SK-OV-3 (ovarieel adenocarcinoom) als in vitro 3D-sferoïde modellen met behulp van gedwongen aggregatiebenaderingen (figuur 1). Het beschrijft ook in detail hoe mitochondriaal energiemetabolisme van enkele 3D-sferoïden kan worden onderzocht met behulp van de Agilent XFe96 XF-analyzer, (ii) wijst op manieren om XF-assays te optimaliseren met behulp van enkele 3D-sferoïden, en (iii) bespreekt belangrijke overwegingen en beperkingen van het onderzoeken van het 3D-sferoïdemetabolisme met behulp van deze aanpak. Het belangrijkste is dat dit artikel beschrijft hoe datasets worden verzameld die de berekening van zuurstofverbruik (OCR) mogelijk maken om oxidatieve fosforylering en dus mitochondriale functie in cellulaire sferoïden te bepalen. Hoewel niet geanalyseerd voor dit protocol, is extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) een andere parameter die wordt gemeten naast OCR-gegevens in XF-experimenten. ECAR wordt echter vaak slecht of onjuist geïnterpreteerd uit XF-datasets. We geven commentaar op de beperkingen van het berekenen van ECAR volgens basisbenaderingen van de technologiefabrikant.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belangrijkste bevindingen en outputs
Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om het mitochondriale energiemetabolisme van enkele 3D-sferoïden te onderzoeken met behulp van een reeks van kanker afgeleide cellijnen met de XFe96 XF Analyzer. Een methode wordt ontwikkeld en beschreven voor de snelle teelt van A549, HepG2/ C3A, MCF7 en SK-OV-3 cellulaire sferoïden met behulp van celafstotende technologieën voor gedwongen aggregatie. Dit protocol behandelt veel overwegingen van het onderzoeken van h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N.J.C werd ondersteund door een BBSRC MIBTP CASE Award met Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)
Materials
| A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
| Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
| Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
| Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
| BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
| Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
| CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
| D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
| EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
| EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
| FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
| Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
| HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
| Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
| L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
| MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
| Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
| Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
| Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
| Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
| SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
| Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
| TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
| Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
| Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |
References
- Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour-stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), 92511 (2014).
- Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental and Clinica Cancer Research. 37 (1), 109 (2018).
- Courau, T., et al. Cocultures of human colorectal tumor spheroids with immune cells reveal the therapeutic potential of MICA/B and NKG2A targeting for cancer treatment. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 74 (2019).
- Ivanova, E., et al. Use of ex vivo patient-derived tumor organotypic spheroids to identify combination therapies for HER2 mutant non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (10), 2393-2403 (2020).
- Mandon, M., Huet, S., Dubreil, E., Fessard, V., Le Hegarat, L. Three-dimensional HepaRG spheroids as a liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports. 9 (1), 10548 (2019).
- Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2020).
- Coltman, N. J., et al. Application of HepG2/C3A liver spheroids as a model system for genotoxicity studies. Toxicology Letters. 345, 34-45 (2021).
- Tchoryk, A., et al. Penetration and uptake of nanoparticles in 3D tumor spheroids. Bioconjugate Chemistry. 30 (5), 1371-1384 (2019).
- Leite, P. E. C., et al. Suitability of 3D human brain spheroid models to distinguish toxic effects of gold and poly-lactic acid nanoparticles to assess biocompatibility for brain drug delivery. Partical Fibre Toxicology. 16 (1), 22 (2019).
- Elje, E., et al. Hepato(Geno)toxicity assessment of nanoparticles in a HepG2 liver spheroid model. Nanomaterials. 10 (3), 545 (2020).
- Conway, G. E., et al. Adaptation of the in vitro micronucleus assay for genotoxicity testing using 3D liver models supporting longer-term exposure durations. Mutagenesis. 35 (4), 319-330 (2020).
- Wang, Z., et al. HepaRG culture in tethered spheroids as an in vitro three-dimensional model for drug safety screening. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 909-917 (2015).
- Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
- Basharat, A., Rollison, H. E., Williams, D. P., Ivanov, D. P. HepG2 (C3A) spheroids show higher sensitivity compared to HepaRG spheroids for drug-induced liver injury (DILI). Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 115279 (2020).
- Benning, L., Peintner, A., Finkenzeller, G., Peintner, L. Automated spheroid generation, drug application and efficacy screening using a deep learning classification: a feasibility study. Scientific Reports. 10 (1), 11071 (2020).
- Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
- Kasianowicz, J., Benz, R., McLaughlin, S. The kinetic mechanism by which CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) transports protons across membranes. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 179-190 (1984).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
- Alexopoulos, S. J., et al. Mitochondrial uncoupler BAM15 reverses diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Communications. 11 (1), 2397 (2020).
- Chen, S. -. Y., et al. Mitochondrial uncoupler SHC517 reverses obesity in mice without affecting food intake. Metabolism – Clinical and Experimental. 117, 154724 (2021).
- Goedeke, L., Shulman, G. I. Therapeutic potential of mitochondrial uncouplers for the treatment of metabolic associated fatty liver disease and NASH. Molecular Metabolism. 46, 101178 (2021).
- Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biological chemistry. 393 (12), 1485-1512 (2012).
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
- Wang, J., et al. Uncoupling effect of F16 is responsible for its mitochondrial toxicity and anticancer activity. Toxicological Sciences. 161 (2), 431-442 (2018).
- Tretter, L., Chinopoulos, C., Adam-Vizi, V. Plasma membrane depolarization and disturbed Na+ homeostasis induced by the protonophore carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazon in isolated nerve terminals. Molecular Pharmacology. 53 (4), 734-741 (1998).
- Connop, B. P., Thies, R. L., Beyreuther, K., Ida, N., Reiner, P. B. Novel effects of FCCP [carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone] on amyloid precursor protein processing. Journal of neurochemistry. 72 (4), 1457-1465 (1999).
- Stöckl, P., et al. Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells. Free Radical Biology and Medicine. 43 (6), 947-958 (2007).
- Firsov, A. M., et al. Protonophoric action of BAM15 on planar bilayers, liposomes, mitochondria, bacteria and neurons. Bioelectrochemistry. 137, 107673 (2021).
- Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 48 (7), 905-914 (2010).
- Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. K., Ertl, P., Kupcu, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D HepG2 spheroid model. Scientific Reports. 9 (1), 4863 (2019).
- vanden Brand, D., Veelken, C., Massuger, L., Brock, R. Penetration in 3D tumor spheroids and explants: Adding a further dimension to the structure-activity relationship of cell-penetrating peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1860 (6), 1342-1349 (2018).
- Niora, M., et al. Head-to-head comparison of the penetration efficiency of lipid-based nanoparticles into tumor spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21162-21171 (2020).
- Millard, M., et al. Drug delivery to solid tumors: the predictive value of the multicellular tumor spheroid model for nanomedicine screening. International Journal of Nanomedicine. 12, 7993-8007 (2017).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Benton, G., DeGray, G., Kleinman, H. K., George, J., Arnaoutova, I. In vitro microtumors provide a physiologically predictive tool for breast cancer therapeutic screening. PLoS One. 10 (4), 0123312 (2015).
- Hirpara, J., et al. Metabolic reprogramming of oncogene-addicted cancer cells to OXPHOS as a mechanism of drug resistance. Redox Biology. 25, 101076 (2019).
- Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
- Song, Y., et al. TGF-β-independent CTGF induction regulates cell adhesion mediated drug resistance by increasing collagen I in HCC. Oncotarget. 8 (13), 21650-21662 (2017).
- Wrzesinski, K., et al. HepG2/C3A 3D spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
- Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5 (4), 1053-1065 (2016).
- Takahashi, Y., et al. 3D spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00208 (2015).
- Hendriks, D. F. G., Puigvert, L. F., Messner, S., Mortiz, W., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic 3D spheroid models for the detection and study of compounds with cholestatic liability. Scientific Reports. 6, 35434 (2016).
- Leung, B. M., Lesher-Perez, S. C., Matsuoka, T., Moraes, C., Takayama, S. Media additives to promote spheroid circularity and compactness in hanging drop platform. Biomaterials Science. 3 (2), 336-344 (2015).
- Cavo, M., et al. A synergic approach to enhance long-term culture and manipulation of MiaPaCa-2 pancreatic cancer spheroids. Scientific Reports. 10 (1), 10192 (2020).
- Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Recent Results in Cancer Research. 95, 1-23 (1984).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnology and Bioengineering. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Zhang, X. D., et al. The use of strictly standardized mean difference for hit selection in primary RNA interference high-throughput screening experiments. Journal of Biomolecular Screening. 12 (4), 497-509 (2007).
- Yepez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), 0199938 (2018).
- Silva, L. P., et al. Measurement of DNA concentration as a normalization strategy for metabolomic data from adherent cell lines. Analytical Chemistry. 85 (20), 9536-9542 (2013).
