Summary

Vektörlü Gen Teslimatı için İnsan Olmayan Bir Primatta Stensen Kanalı aracılığıyla Retrograd Parotid Bezi İnfüzyonu

Published: August 12, 2021
doi:

Summary

Tükürük bezleri, özellikle gen transferi ile aşılama alanında gen tedavisi için doku hedef bölgesi olarak önerilmiştir. Retrograd parotis infüzyonu kullanarak insan olmayan bir primat modelinde gen iletimi gösteriyoruz.

Abstract

Tükürük bezleri gen tedavisi için çekici bir doku hedefidir ve umut verici sonuçlar zaten insan deneylerine yol açıpmaktadır. Doğal olarak kan dolaşımına protein salgılayabilirler ve kolayca erişilebilirler, bu da onları gen transferi ile hormon üretimi veya aşılanması için potansiyel olarak üstün doku bölgeleri haline getirir. Gen iletimi için önerilen yöntemler arasında transkütan enjeksiyon ve tükürük kanalları yoluyla retrograd infüzyon bulunur. İnsan olmayan primatlarda Retrograd Tükürük Bezi İnfüzyonunun (RSGI) nasıl gerçekleştirildiğini gösteriyoruz. Temel diş aletleri, polietilen boru ve siyanoakrilat kullanarak Stensen Kanalı’nı kanüle etmek ve sızdırmaz hale getirebilir atraumatik bir yöntem olan parotis papillanın tanımlanması ve uygun infüzyon oranı da dahil olmak üzere önemli anatomik simgesel yapıları açıklıyoruz. Bu en az travmatik doğum yöntemi olmakla birlikte, yöntem hala teslim edilebilen hacim (<0,5 mL) ve kanal ve bezde travma potansiyeli ile sınırlıdır. Floroskopi kullanarak bir infüzyonun beze tam olarak teslim edilebileceğini gösteriyoruz ve immünhistokimya ile tipik bir vektörün transdüksiyonunun ve verilen genin ekspresyonunun daha da gösterileceğini gösteriyoruz.

Introduction

Tükürük bezleri tükürük ekzokrin üretimi ile iyi bilinirken, araştırmacılar proteinleri doğrudan kan dolaşımına salgılama yeteneklerini uzun zamandır fark etmişlerdir 1 , bu da onları yedek hormonlar veya antikor üretimi gibi sistemik uygulama için gen tedavisi için potansiyel bir hedefhalinegetirmektedir. Aslında, tükürük bezleri, salgı için protein üretme yeteneği (bir özellik kaslarının eksikliği), vektör difüzyonunu sınırlandırabilen ağır kapsülleme ve entegre olmayan vektörler için stabilite sağlayan iyi ayırt edilmiş doku gibi diğer doku hedeflerine göre çeşitli avantajlar sunar. Ayrıca, ciddi bir olumsuz olay durumunda, tükürük bezleri yaşam için kritik değildir ve cerrahi olarak çıkarılabilir. Hemen sezgisel olmasa da, parotis bezlerine ana boşaltım kanalı olan Stensen’s Duct2aracılığıyla ağızdan kolayca erişilebilir.

Tükürük dokusunun gen tedavisi için avantajları göz önüne alındığında, bu doku hedefini keşfetmeye olan ilgi artmaktadır. Kemirgen, köpek ve insan dışı primat modellerinde çok sayıda çalışma zaten yapıldı ve en az bir insan klinik çalışması devam ediyor3,4,5. Gen tedavisi amacıyla bu doku hedefinin yararını daha fazla araştırmak ve geliştirmek için daha fazla insan dışı primat çalışması yapılması gerekecektir. Bu makalede, insan olmayan primat modelinde transdüksiyon için vektörel bir gen sunmak için Stensen Kanalı aracılığıyla parotis bezlerine erişmek için bir yöntem açıklanmaktadır. İnfüzyonun doğumunun ve kanalın beze girerken anatomisinin gözle görülür bir şekilde ortaya konmasını sağlamak için radyokontrast kullanılarak floroskopi yapıldı. Bir vektörün başarılı bir şekilde transdüksiyonunun ortaya konması için Adenovirüs serotip 5 (Ad5) vektörlü egfp geni kullanılmıştır. Ad5 tükürük dokusunu transdükleyebilen iyi tanımlanmış bir vektördür. Nihai klinik kullanım için çok immünojenik olmasına rağmen, verimli transdüksiyon sağlamak için bu gösteri çalışması için bir Ad5 vektörü seçilmiştir. Geliştirilmiş Yeşil Floresan Protein (EGFP) üretiminin değerlendirilmesi, transdüksiyondan sonra vektörel bir genin başarılı transkripsiyonunu ve çevirisini göstermek için iyi tanımlanmış bir yöntemdir ve burada yapılmıştır.

Protocol

Tüm işlemler hayvan çalışmaları için Wake Forest School of Medicine Clarkson Kampüsü’nde gerçekleştirildi. Etik hususlar için Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi’ne (IACUC) danışıldı ve prosedürlerin ayrıntıları incelenmek üzere sunuldu. Wake Forest IACUC çalışma protokolümüzü onayladı ve tüm prosedürler IACUC onaylı protokol #A17-147 kapsamında yapıldı. 1. infüzyon cihazının hazırlanması Bir makas kullanarak 10 Polietilen Tüp (PET10) …

Representative Results

Başarılı prosedür, transdüksiyon ve transkripsiyonŞekil 1, arka üst yanak üzerindeki 2nd azı dişine bitişik parotis papillayı gösterir. Görüntü ayrıca ağız ayracı, bir lastik ucu sert damakta ve diğer lastik ucun ipsilateral köpek üzerinde doğru yerleşimini gösterir. Şekil 2, PAROTID papillanın PET10’daki 2 cm işaretinde başarılı bir şekilde canülasyonundan sonra çekilen bir görüntüyü göster…

Discussion

Burada, Stensen Kanalı aracılığıyla parotis bezine retrograd infüzyon protokolünü açıklıyoruz. Açıklanan metodoloji, gen tedavisi ve diğer uygulamalar için bir alan olarak tükürük dokusunun yararını araştıran araştırmacılar tarafından potansiyel olarak kullanılabilecek rehberlik sunmaktadır.

Yordamın başarısını sağlamak için birden çok kritik adım vardır. Her şeyden önce, tüm prosedür adımları nazikçe tamamlanmalıdır. Ağzın güçlü bir şekilde…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Prosedürün filme alınmasındaki görsel-işitsel desteği için Bay Cagney Gentry’ye teşekkür etmek istiyorlar. Ayrıca, bu projenin takibinde akademik destek için Hefner VA tıp merkezini de kabul etmek istiyoruz.

Materials

500 µL U100 syringes with 30-gauge needles Becton Dickinson 328466 fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) Various Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution Patterson Veterinary 07 869-6061 Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G Walmart N/A Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue) Ethicon DNX12 Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light Amazon (DDP) B012M3IV80 Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator Surgipro SPOI-137
Ketamine injectable solution Patterson Veterinary 07-803-6637 Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator Surgipro SPOI-132 Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution Patterson Veterinary 07 890-6698 Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors Amazon (DDP) N/A Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10) Scientific Comodities, Inc BB31695-PE/1 Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips Walmart N/A Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) Scientific Commodities BB31695-PE/1 low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener Amazon (DDP) B01F3LVJXC Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers Amazon (DDP) N/A Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 7646-86-7 Included in plasmid DNA infusates

References

  1. Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
  2. Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
  3. Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
  4. Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
  5. Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
  6. Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
  7. Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
  8. Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
  9. Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , (2011).
  10. Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).

Play Video

Cite This Article
El Helou, G., Goodman, J. F., Blevins, M., Caudell, D. L., Ponzio, T. A., Sanders, J. W. Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen’s Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery. J. Vis. Exp. (174), e62645, doi:10.3791/62645 (2021).

View Video