Summary

Retrograde parotisklierinfusie via het kanaal van Stensen in een niet-menselijke primaat voor vectored genafgifte

Published: August 12, 2021
doi:

Summary

Speekselklieren zijn voorgesteld als een weefseldoelplaats voor gentherapie, vooral op het gebied van vaccinatie door genoverdracht. We demonstreren genafgifte in een niet-menselijk primatenmodel met behulp van retrograde parotisinfusie.

Abstract

Speekselklieren zijn een aantrekkelijk weefseldoel voor gentherapie met veelbelovende resultaten die al leiden tot menselijke proeven. Ze zijn inherent in staat om eiwitten in de bloedbaan af te scheiden en zijn gemakkelijk toegankelijk, waardoor ze potentieel superieure weefselplaatsen zijn voor vervangingshormoonproductie of vaccinatie door genoverdracht. Voorgestelde methoden voor genafgifte omvatten transcutane injectie en retrograde infusie via speekselkanalen. We demonstreren hoe retrograde speekselklierinfusie (RSGI) moet worden uitgevoerd bij niet-menselijke primaten. We beschrijven de belangrijke anatomische oriëntatiepunten, waaronder de identificatie van de parotis papilla, een atraumatische methode voor het cannuleren en afdichten van Stensen’s Duct met behulp van elementaire tandheelkundige hulpmiddelen, polyethyleenbuizen en cyanoacrylaat, en de juiste infusiesnelheid. Hoewel dit de minst traumatische methode van levering is, wordt de methode nog steeds beperkt door het volume dat kan worden afgeleverd (<0,5 ml) en het potentieel voor trauma aan het kanaal en de klier. We tonen met behulp van fluoroscopie aan dat een infundaat volledig in de klier kan worden afgeleverd en tonen verder aan door immunohistochemie de transductie van een typische vector en expressie van het afgeleverde gen.

Introduction

Hoewel speekselklieren bekend staan om hun exocriene productie van speeksel, hebben onderzoekers al lang hun vermogen erkend om eiwitten rechtstreeks in de bloedbaan af tescheiden 1, waardoor ze een potentieel doelwit zijn voor gentherapie voor systemische toediening, zoals vervangingshormonen of antilichaamproductie. In feite bieden speekselklieren verschillende voordelen ten opzichte van andere weefseldoelen, zoals het inherente vermogen om eiwitten te produceren voor secretie (een eigenschap die spieren missen), zware inkapseling die vectordiffusie kan beperken en goed gedifferentieerd weefsel dat stabiliteit biedt voor niet-integrerende vectoren. Bovendien zijn speekselklieren in het geval van een ernstige bijwerking niet kritiek voor het leven en kunnen ze operatief worden verwijderd. Hoewel niet onmiddellijk intuïtief, zijn parotisklieren ook gemakkelijk toegankelijk vanuit de mond via hun belangrijkste uitscheidingskanaal, Stensen’s Duct2.

Gezien de voordelen van speekselweefsel voor gentherapie, is er steeds meer interesse in het verkennen van dit weefseldoel. Talrijke studies zijn al uitgevoerd in knaagdier-, honden- en niet-menselijke primatenmodellen en ten minste één klinische proef bij mensen is aan de gang3,4,5. Om het nut van dit weefseldoel voor gentherapiedoeleinden verder te onderzoeken en te ontwikkelen, zullen meer niet-menselijke primatenstudies moeten worden uitgevoerd. Dit artikel beschrijft een methode voor toegang tot de parotisklieren via Stensen’s Duct om een vectored gen voor transductie af te leveren in het niet-menselijke primaatmodel. Om de afgifte van het infundaat en de anatomie van het kanaal bij het binnenkomen van de klier zichtbaar aan te tonen, werd fluoroscopie met behulp van radiocontrast uitgevoerd. Om succesvolle transductie van een vector aan te tonen, werd een Adenovirus serotype 5 (Ad5) vectored egfp-gen gebruikt. Ad5 is een goed beschreven vector die speekselweefsel kan transduceren. Hoewel het te immunogeen is voor ultiem klinisch gebruik, werd voor deze demonstratiestudie een Ad5-vector gekozen om efficiënte transductie te garanderen. Het evalueren van Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) productie is een goed beschreven methode om succesvolle transcriptie en translatie van een vectored gen na transductie aan te tonen en werd hier gedaan.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd op wake forest school of medicine Clarkson Campus voor dierstudies. Het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) werd geraadpleegd voor ethische overwegingen en details van de procedures werden ter beoordeling voorgelegd. Wake Forest IACUC keurde ons onderzoeksprotocol goed en alle procedures werden uitgevoerd onder het door IACUC goedgekeurde protocol #A17-147. 1. Voorbereiding van het infuusapparaat Knip maat 10 Polyethyleen Buis (PET10)…

Representative Results

Succesvolle procedure, transductie en transcriptieFiguur 1 toont de parotis papilla grenzend aan de2e kies op de achterste superieure wang. De afbeelding toont ook de juiste plaatsing van de mondbeugel, een rubberen uiteinde op het harde gehemelte en het andere rubberen uiteinde op de ipsilaterale hond. Figuur 2 toont een afbeelding genomen na succesvolle cannulatie van de parotis papilla op de 2 cm markering op de PET10. <strong …

Discussion

Hier beschrijven we een protocol van retrograde infusie in de parotisklier via het kanaal van Stensen. De beschreven methodologie biedt richtlijnen die mogelijk kunnen worden gebruikt door onderzoekers die het nut van speekselweefsel onderzoeken als een site voor gentherapie en andere toepassingen.

Er zijn meerdere kritieke stappen om het succes van de procedure te garanderen. Eerst en vooral moeten alle procedurele stappen voorzichtig worden voltooid. Krachtige versteviging van de mond kan le…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen de heer Cagney Gentry bedanken voor zijn audiovisuele ondersteuning bij het filmen van de procedure. We willen ook het Hefner VA medisch centrum erkennen voor academische ondersteuning bij het nastreven van dit project.

Materials

500 µL U100 syringes with 30-gauge needles Becton Dickinson 328466 fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) Various Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution Patterson Veterinary 07 869-6061 Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G Walmart N/A Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue) Ethicon DNX12 Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light Amazon (DDP) B012M3IV80 Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator Surgipro SPOI-137
Ketamine injectable solution Patterson Veterinary 07-803-6637 Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator Surgipro SPOI-132 Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution Patterson Veterinary 07 890-6698 Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors Amazon (DDP) N/A Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10) Scientific Comodities, Inc BB31695-PE/1 Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips Walmart N/A Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) Scientific Commodities BB31695-PE/1 low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener Amazon (DDP) B01F3LVJXC Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers Amazon (DDP) N/A Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 7646-86-7 Included in plasmid DNA infusates

References

  1. Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
  2. Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
  3. Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
  4. Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
  5. Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
  6. Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
  7. Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
  8. Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
  9. Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , (2011).
  10. Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).

Play Video

Cite This Article
El Helou, G., Goodman, J. F., Blevins, M., Caudell, D. L., Ponzio, T. A., Sanders, J. W. Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen’s Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery. J. Vis. Exp. (174), e62645, doi:10.3791/62645 (2021).

View Video