Infusión de la glándula parótida retrógrada a través del conducto de Stensen en un primate no humano para la entrega de genes vectores
Summary
Las glándulas salivales se han propuesto como un sitio objetivo tisular para la terapia génica, especialmente en el área de la vacunación por transferencia de genes. Demostramos la entrega de genes en un modelo de primates no humanos utilizando infusión de parótida retrógrada.
Abstract
Las glándulas salivales son un objetivo tisular atractivo para la terapia génica con resultados prometedores que ya conducen a ensayos en humanos. Son inherentemente capaces de secretar proteínas en el torrente sanguíneo y son fácilmente accesibles, lo que los convierte en sitios de tejido potencialmente superiores para la producción de hormonas de reemplazo o la vacunación por transferencia de genes. Los métodos sugeridos para la administración de genes incluyen la inyección transcutánea y la infusión retrógrada a través de conductos salivales. Demostramos cómo realizar la infusión retrógrada de glándulas salivales (RSGI) en primates no humanos. Describimos los hitos anatómicos importantes, incluida la identificación de la papila parótida, un método atraumático de canulación y sellado del conducto de Stensen que utiliza herramientas dentales básicas, tubos de polietileno y cianoacrilato, y la velocidad adecuada de infusión. Si bien este es el método de parto menos traumático, el método todavía está limitado por el volumen que se puede administrar (<0.5 ml) y el potencial de trauma en el conducto y la glándula. Demostramos mediante fluoroscopia que un infusato se puede administrar completamente en la glándula, y demostramos además por inmunohistoquímica la transducción de un vector típico y la expresión del gen entregado.
Introduction
Si bien las glándulas salivales son bien conocidas por su producción exocrina de saliva, los investigadores han reconocido durante mucho tiempo su capacidad para secretar proteínas directamente en el torrente sanguíneo1,lo que las convierte en un objetivo potencial para la terapia génica para la administración sistémica, como las hormonas de reemplazo o la producción de anticuerpos. De hecho, las glándulas salivales ofrecen varias ventajas sobre otros objetivos tisulares, como la capacidad inherente de producir proteínas para la secreción (una propiedad de la que carecen los músculos), la encapsulación pesada que puede limitar la difusión vectorial y el tejido bien diferenciado que proporciona estabilidad para los vectores no integradores. Además, en caso de un evento adverso grave, las glándulas salivales no son críticas para la vida y pueden extirparse quirúrgicamente. Aunque no son inmediatamente intuitivas, las glándulas parótidas también son fácilmente accesibles desde la boca a través de su conducto excretor principal, el conducto2de Stensen.
Dadas las ventajas del tejido salival para la terapia génica, existe un creciente interés en explorar este objetivo tisular. Ya se han realizado numerosos estudios en modelos de roedores, caninos y primates no humanos y al menos un ensayo clínico en humanos está en marcha3,4,5. Para explorar y desarrollar aún más la utilidad de este objetivo tisular con fines de terapia génica, se necesitarán más estudios de primates no humanos. Este artículo describe un método para acceder a las glándulas parótidas a través del conducto de Stensen para entregar un gen vector para la transducción en el modelo de primates no humanos. Para demostrar visiblemente la entrega de la infusión y la anatomía del conducto a medida que ingresa a la glándula, se realizó fluoroscopia con radiocontraste. Para demostrar la transducción exitosa de un vector, se utilizó un gen egfp vectorado por adenovirus serotipo 5 (Ad5). Ad5 es un vector bien descrito capaz de transducir tejido salival. Aunque es demasiado inmunogénico para el uso clínico final, se eligió un vector Ad5 para este estudio de demostración para garantizar una transducción eficiente. La evaluación de la producción mejorada de proteína fluorescente verde (EGFP) es un método bien descrito para demostrar la transcripción y traducción exitosas de un gen vectorado después de la transducción y se realizó aquí.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un protocolo de infusión retrógrada en la glándula parótida a través del conducto de Stensen. La metodología descrita ofrece orientación que potencialmente puede ser utilizada por investigadores que exploran la utilidad del tejido salival como un sitio para la terapia génica y otras aplicaciones.
Hay múltiples pasos críticos para garantizar el éxito del procedimiento. En primer lugar, todos los pasos del procedimiento deben completarse suavemente. El refuerzo contu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer al Sr. Cagney Gentry su apoyo audiovisual en la filmación del procedimiento. También queremos reconocer al centro médico Hefner VA por su apoyo académico en la búsqueda de este proyecto.
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
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