Summary

ضخ الغدة الباروتية الرجعية من خلال قناة ستينسن في الرئيسيات غير البشرية لتسليم الجينات المتجهة

Published: August 12, 2021
doi:

Summary

وقد اقترحت الغدد اللعابية كموقع مستهدف للأنسجة للعلاج الجيني، ولا سيما في مجال التطعيم عن طريق نقل الجينات. نحن نثبت تسليم الجينات في نموذج الرئيسيات غير البشرية باستخدام التسريب السباتي الرجعي.

Abstract

الغدد اللعابية هي هدف الأنسجة جذابة للعلاج الجيني مع نتائج واعدة تؤدي بالفعل إلى التجارب على الإنسان. فهي قادرة بطبيعتها على إفراز البروتينات في مجرى الدم ويمكن الوصول إليها بسهولة، مما يجعلها مواقع أنسجة متفوقة محتملة لإنتاج هرمون بديل أو التطعيم عن طريق نقل الجينات. وتشمل الطرق المقترحة لتسليم الجينات الحقن عبر الجلد والضخ الرجعي من خلال القنوات اللعابية. نحن نبين كيفية إجراء ضخ الغدة اللعابية الرجعية (RSGI) في الرئيسيات غير البشرية. نحن نصف المعالم التشريحية الهامة بما في ذلك تحديد الحليمة الباروتية ، وهي طريقة صدمية لتكتل وختم قناة ستينسن باستخدام أدوات الأسنان الأساسية ، وأنابيب البولي إيثيلين ، وسيانواكريلات ، والمعدل المناسب للتسريب. في حين أن هذه هي الطريقة الأقل صدمة للتسليم ، إلا أن الطريقة لا تزال محدودة بسبب الحجم الذي يمكن تسليمه (<0.5 مل) واحتمال حدوث صدمة في القناة والغدة. نحن نثبت باستخدام التنظير الفلوري أنه يمكن تسليم غرسة بالكامل في الغدة ، ونثبت كذلك من خلال الكيمياء المناعية نقل ناقل نموذجي والتعبير عن الجين المسلم.

Introduction

في حين أن الغدد اللعابية معروفة بإنتاجها للإفرازات من اللعاب ، فقد أدرك الباحثون منذ فترة طويلة قدرتها على إفراز البروتينات مباشرة في مجرى الدم1، مما يجعلها هدفا محتملا للعلاج الجيني للإدارة الجهازية ، مثل الهرمونات البديلة أو إنتاج الأجسام المضادة. في الواقع ، توفر الغدد اللعابية العديد من المزايا على أهداف الأنسجة الأخرى ، مثل القدرة المتأصلة على إنتاج البروتينات للإفراز (نقص عضلات الخاصية) ، والتغليف الثقيل الذي يمكن أن يحد من انتشار النواقل ، والأنسجة المتباينة جيدا التي توفر الاستقرار للناقلات غير المتكاملة. وعلاوة على ذلك، في حالة حدوث حدث سلبي خطير، الغدد اللعابية ليست حاسمة للحياة ويمكن إزالتها جراحيا. في حين لا بديهية على الفور، الغدد السباتية هي أيضا يمكن الوصول إليها بسهولة من الفم من خلال القناة إفراز الرئيسية، القناة ستينسن2.

نظرا لمزايا الأنسجة اللعابية للعلاج الجيني ، هناك اهتمام متزايد باستكشاف هذا الهدف النسيجي. وقد أجريت بالفعل العديد من الدراسات في القوارض, ال, ونماذج الرئيسيات غير البشرية وعلى الأقل تجربة سريرية بشرية واحدة جارية3,4,5. ولمزيد من استكشاف وتطوير فائدة هذا الهدف من الأنسجة لأغراض العلاج الجيني، سيتعين إجراء المزيد من الدراسات غير البشرية على الرئيسيات. تصف هذه الورقة طريقة للوصول إلى الغدد السباتية من خلال قناة ستينسن لتقديم جين متجه للعبور في نموذج الرئيسيات غير البشرية. لإثبات بشكل واضح تسليم غرس وتشريح القناة عند دخولها الغدة ، تم إجراء التنظير الفلوري باستخدام الاتصالات الراديوية. ولإثبات نجاح نقل ناقل، استخدم جين فيروس أدينو المصلي 5 (Ad5) الموجه egfp. Ad5 هو ناقل يوصف جيدا قادرة على تحويل الأنسجة اللعابية. على الرغم من أنه مناعي للغاية للاستخدام السريري النهائي ، فقد تم اختيار ناقل Ad5 لهذه الدراسة التجريبية لضمان النقل الفعال. تقييم إنتاج البروتين الفلوري الأخضر المحسن (EGFP) هو طريقة موصوفة جيدا لإثبات النسخ الناجح والترجمة لجين متجه بعد النقل وتم القيام به هنا.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات في كلية ويك فورست للطب كلاركسون الحرم الجامعي للدراسات الحيوانية. واستشيرت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه للاعتبارات الأخلاقية وقدمت تفاصيل الإجراءات لاستعراضها. وافق Wake Forest IACUC على بروتوكول دراستنا وتم تنفيذ جميع الإجراءات بموجب البروتوكول المعتمد م?…

Representative Results

إجراء ناجح، ونقل ونسخيظهر الشكل 1 الحليمة الباروتية المجاورة للضرسالثاني على الخد العلوي الخلفي. تظهر الصورة أيضا الموضع الصحيح لتقويم الفم ، ونهاية مطاطية واحدة على الحنك الصلب والنهاية المطاطية الأخرى على ال ipsilateral. يظهر الشكل 2 صورة تم …

Discussion

هنا نصف بروتوكول التسريب إلى الوراء في الغدة السباتية من خلال قناة ستينسن. تقدم المنهجية الموصوفة إرشادات يمكن استخدامها من قبل الباحثين الذين يستكشفون فائدة الأنسجة اللعابية كموقع للعلاج الجيني والتطبيقات الأخرى.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة لضمان نجاح الإجراء. أولا و…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يريد المؤلفون أن يشكروا السيد كاغني جنتري على دعمه السمعي البصري في تصوير الإجراء. نريد أيضا أن نعترف بمركز Hefner VA الطبي للحصول على الدعم الأكاديمي في متابعة هذا المشروع.

Materials

500 µL U100 syringes with 30-gauge needles Becton Dickinson 328466 fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) Various Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution Patterson Veterinary 07 869-6061 Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G Walmart N/A Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue) Ethicon DNX12 Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light Amazon (DDP) B012M3IV80 Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator Surgipro SPOI-137
Ketamine injectable solution Patterson Veterinary 07-803-6637 Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator Surgipro SPOI-132 Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution Patterson Veterinary 07 890-6698 Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors Amazon (DDP) N/A Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10) Scientific Comodities, Inc BB31695-PE/1 Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips Walmart N/A Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) Scientific Commodities BB31695-PE/1 low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener Amazon (DDP) B01F3LVJXC Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers Amazon (DDP) N/A Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 7646-86-7 Included in plasmid DNA infusates

References

  1. Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
  2. Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
  3. Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
  4. Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
  5. Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
  6. Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
  7. Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
  8. Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
  9. Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , (2011).
  10. Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).

Play Video

Cite This Article
El Helou, G., Goodman, J. F., Blevins, M., Caudell, D. L., Ponzio, T. A., Sanders, J. W. Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen’s Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery. J. Vis. Exp. (174), e62645, doi:10.3791/62645 (2021).

View Video