逆行帕罗蒂德格兰德输液通过斯滕森的管道在非人类灵长类病原体矢量基因交付
Summary
唾液腺已被提议为基因治疗的组织靶点，特别是在通过基因转移接种疫苗方面。我们演示了利用逆行性皮质输液的非人类灵长类动物模型中的基因传递。
Abstract
唾液腺是基因治疗的有吸引力的组织靶点，其有希望的结果已经导致人体试验。它们天生就能够将蛋白质分泌到血液中，并且很容易获得，因此它们有可能成为替代激素生产或通过基因转移接种疫苗的优越组织部位。建议的基因传递方法包括皮下注射和通过唾液导管逆行输液。我们演示如何在非人类灵长类动物中执行逆行唾液格兰输液 （RSGI）。我们描述了重要的解剖学地标，包括鉴定帕皮拉，一种利用基本牙科工具、聚乙烯管和氰酸丙烯酸酯对斯滕森的导管进行罐装和密封的创伤性方法，以及适当的输液率。虽然这是创伤最小的分娩方法，但该方法仍然受到能够交付的体积（<0.5 mL）以及管道和腺体可能遭受创伤的限制。我们使用荧光镜检查证明，注入物可以完全输送到腺体中，并通过免疫造血术进一步证明典型载体的转导和传递基因的表达。
Introduction
虽然唾液腺以产生唾液的外分泌而闻名，但研究人员早已认识到它们能够将蛋白质直接分泌到血液中，从而成为系统性施用（如替代激素或抗体生产）基因治疗的潜在靶点。事实上，唾液腺比其他组织靶点具有几个优势，例如产生分泌蛋白质的固有能力（缺乏特性肌肉）、可以限制病媒扩散的重封装，以及为不整合载体提供稳定性的分化良好的组织。此外，在发生严重不良事件时，唾液腺对生命不至关重要，可以手术切除。虽然不是立即直观，帕罗蒂腺也很容易从嘴里通过他们的主要排泄管道，斯滕森的管道2。
鉴于唾液组织对基因治疗的益处，人们越来越有兴趣探索这一组织目标。在啮齿动物、犬类和非人类灵长类动物模型中已经进行了许多研究，至少一项人类临床试验正在进行中。为了进一步探索和发展这种组织靶点用于基因治疗的目的，将需要更多的非人类灵长类动物研究。本文描述了一种通过斯滕森的管子访问帕罗蒂腺的方法，以提供一个向量基因，用于在非人类灵长类动物模型中进行转导。为了明显地演示输液和管道进入腺体的解剖学，使用放射性对照器进行了荧光镜检查。为了证明一个载体的成功转导，使用了腺病毒血清型5（Ad5）矢量egfp基因。Ad5 是一种描述良好的载体，能够转导唾液组织。虽然它太免疫原性，最终临床使用，Ad5载体被选中为这个示范研究，以确保有效的转导。评估增强型绿色荧光蛋白 （EGFP） 的生产是一种经过充分描述的方法，可以证明转导后向量基因的转录和翻译成功，并在此完成。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了通过斯滕森的管道向帕罗蒂德腺体进行逆行输注的协议。所描述的方法提供了指导，研究人员可以探索唾液组织作为基因治疗和其他应用场所的效用。
有许多关键步骤可以确保程序的成功。首先，所有程序步骤都应轻轻完成。有力的支撑嘴可能导致气管下行。强制罐装的帕皮拉或快速注入溶液到斯滕森的管道可能导致急性导管撕裂或慢性导管狭窄。
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢卡格尼·盖特先生在拍摄过程中的视听支持。我们还要感谢赫夫纳VA医疗中心为追求这个项目提供学术支持。
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
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