Antegrad perfüzyon tekniği ile yüksek kaliteli bireysel fare kalp hücrelerini izole etmek için basit bire yöntemi geliştirdik. Bu yöntem Langendorff içermez ve kardiyak fibroblastlar veya progenitörler gibi ventrikül ve atriyal miyositleri veya interstisyel hücreleri izole etmek için yararlıdır.
Fare kalbi kullanılarak yapılan temel araştırmalarda, uygulanabilir bireysel kardiyomiyositleri izole etmek üstesinden gelinmesi gereken önemli bir teknik adımdır. Geleneksel olarak, tavşanlardan, kobaylardan veya sıçanlardan kardiyomiyositlerin izole edilmesi, langendorff aparatı kullanılarak enzimlerle kalbin retrograd perfüzyonu yoluyla gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu yöntem küçük bir fare kalbi ile kullanıldığında yüksek derecede beceri gerekir. Yakın zamanda fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu için Langendorff aparatı kullanmayan bir antegrad perfüzyon yöntemi bildirilmiştir. Burada, yetişkin farelerden (8 – 108 haftalık) bireysel kalp hücrelerini izole etmek için ekscise kalbin gelişmiş antegrad perfüzyonu için tam bir protokol bildiriyoruz. Antegrad perfüzyon, bir infüzyon pompası kullanılarak, aortları kenetlenmiş olan eksizyon kalbinin sol ventrikülünün zirvesine perfüzyon enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Tüm prosedürler, enjeksiyon ve perfüzyon işlemlerinin izlenmesini sağlayan mikroskop altında önceden ısıtılmış bir ısıtıcı paspas üzerinde gerçekleştirilir. Sonuçlar, ventrikül ve atriyal miyositlerin ve fibroblastların aynı anda tek bir yetişkin fareden iyi izole edilebileceğini göstermektedir.
Genel olarak, parçalanmış dokunun tek hücre izolasyonunun ilk adımı, dokuyu küçük parçalara ayırmayı, ardından bağ dokusunun ve hücre dışı matrisin enzimlerle sindirilmesini içerir. Bununla birlikte, kardiyomiyositler böyle bir doğrama yöntemiyle izole edilemez, çünkü kollajen ve elastin lifleri de dahil olmak üzere hücre dışı matris bileşenleriyle zenginleştirme miyokardları kıymak için çok zor hale getirir ve kardiyomiyositler hipoksiye ve mikroçevrimdeki diğer değişikliklere karşı oldukça hassastır. Böylece, Langendorff tabanlı retrograd perfüzyon sistemi1kullanılarak, hücre dışı matrisi enzimlerle sindirme yöntemi, bireysel kardiyomiyositleri kalpten izole etmek için geliştirilmiştir2,3,4.
Fare modellerinde, langendorff bazlı retrograd perfüzyon kalbin enzimlerle perfüzyonu, bireysel kardiyomiyositlerinizolasyonuiçin de kullanılır 5 ,6,7,8. Bununla birlikte, küçük ve ince fare aortunun kanülasyonu ve retrograd perfüzyon yapmak için Langendorff aparatına montesi yüksek derecede beceri gerektirir, çünkü yetişkin kalbindeki aortu çapı yaklaşık 1,2 mm’dir. Ayrıca, Langendorff aparatı bir sonraki kalbe perfüzyon yapmadan önce temizlenmesi gerektiğinden, birden fazla deney yapmak zaman alır.
Retrograd perfüzyona alternatif olarak, langendorff aparatı olmadan yetişkin bir fare kalbinden kardiyomiyositleri izole etmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu çağ yapma yöntemi koroner arterlerin antegrad perfüzyonunu temel9. Son zamanlarda aortu sıkıştırma, iğne takma ve sıcaklık kontrolü gibi bu antegrad protokolün her adımını geliştirdik ve tüm perfüzyon prosedürlerini mikroskop10ile izledik. Burada, izolasyon süresini kısaltmak ve ek bir video sağlamak için bu antegrad perfüzyon yönteminin inceliğini ayrıntılı olarak rapor ediyoruz. Bu yöntemde, kalbin perfüzyonu enzimlerin 10 mL’si ile yaklaşık 7 dakika sürer ve bu kısa sindirim süresi hücrelerin canlılığını arttırır. Bu, 2,3 butanedione monoksim (BDM)6,11 veya taurin5,8gibi kimyasalların eklenmesini gerektirmeden tek kalp hücrelerini yüksek kalitede izole etmek için basit bir yöntemdir. Bu yöntemin tekniğin beceri eşiğini düşüreceğine ve temel araştırmalarda fare kardiyomiyositlerinin yararını artıracağına inanıyoruz.
Kalp iskemiye karşı oldukça hassas olduğundan, kalbi çıkarmak ve kasılmayı durdurmak için buz gibi CIB-EGTA’ya daldırmak için geçen süre mümkün olduğunca kısa tutulmalıdır (<1 dk). Bu, bu yöntemin ilk kritik adımıdır. İkinci kritik adım kalbin yönüyle ilgilidir. 2.1.2. adımda ekscise kalbin özel yönelimi, aortu etrafındaki yağ ve bağ dokularını görmeyi ve çıkarmayı kolaylaştırır. Aortu temizledikten sonra, kenetlenmiş kalbi ön yüzey tarafı perfüzyon plakasına yerleştirin. Son kritik adım enjeksiyon iğnesinin yerleştirilmesini içerir. İğneyi kalbe doğru ilerletirken, plakadan sabit bir mesafeyi korumak için enjeksiyon iğnesi perfüzyon plakasından ayrılmamalıdır. Yerleştirmenin konumu sol ventrikülün tepeye yakındır. İğneyi bükmeden dikkatlice yerleştirin, çünkü bu bükülme deliği büyütebilir. İğnenin takılmasının derinliği kırmızı işaret izlenerek tahmin edilebilir. İğne çok derine yerleştirilirse, uç ventrikül septumunu delebilir ve sağ ventrikül veya mitral kapakçık ile sol kulakçık girebilir. Kanın koroner arterden kaybolduğunu doğruladıktan sonra, iğne perfüzyon plakasına bantla sabitlenmelidir.
Daha uzun bir aort uzunluğu, aortu doğru konumda sıkıştırmayı zorlaştırır. Kelepçe atria’dan çok uzaksa, perfüzyon infüzyonundan sonra kalp dönebilir. Bunu önlemek için, kenetlenmeden önce aortu kısaltmak için brakifalik arterin hemen altındaki aortu kesin.
Perfüzyondan sonra kan 0,5 mL/dk başlangıç hızında boşalmaya başlamazsa, hızı 1 mL/dk’ya çıkarın. Bu yardımcı olmazsa, enjeksiyon iğnesi sağ ventrikül, ventrikül septum veya sol miyokard duvarı gibi yanlış konumlandırılabilir. Böyle bir durumda, iğneyi hemen çıkarın ve sol ventrikülün zirvesine yakın bir yerine yeniden yerleştirmeye çalışın. İğneyi birkaç kez yerleştirirken, sindirilmiş hücreler açılan deliklerden dışarı akabilir. Bunun genellikle hücre izolasyonu ciddi şekilde etkilemediğini unutmayın.
Operatörler, renk ve saydamlıktaki değişiklikleri gözlemlemek ve sindirimle birlikte aryanın atışını yeniden başlatmak için stereoskopik bir mikroskop kullanarak kalbin tüm antegrad perfüzyon sürecini izleyebilir. Toplam 10 mL enzim karışımı, eski bir kalp için bile gereken maksimum değer olmalıdır. Genç kalplerde (5-7 haftalık), hacmi aynı enzim karışımı ile retrograd perfüzyon yoluyla yaklaşıma benzer şekilde 9 mL’ye düşürüyoruz.
Son santrifüjdeki süpernatant döküntüler, kan hücreleri ve miyosit olmayanlar içerirken, pelet esas olarak kardiyomiyositler ve fibroblastlar ve endotel hücreleri gibi kirletici miyositler içerir. Kardiyomiyositleri arındırmak için daha fazla adıma ihtiyaç vardır. Genel olarak, pelet uygun hücre kültürü ortamında yeniden kullanılmalı ve bir doku hücresi kültür çanağı üzerinde 37 °C’de 2 saat önceden tabaklanmalı ve daha sonra kültür için pipetleme ve ön plaka ile kardiyomiyositleri nazikçe çıkarılmalıdır.
Enzim karışımı düşük konsantrasyonda Ca2+ (0.3 mM) içerir. Bu nedenle, hücre resüspenzyon çözeltisi(1.8mM Ca 2+ ) ile son resüspenzyondan önce CIB-Ca2+-BSA’da (1.2 mM Ca2+) sindirilmiş hücreleri kuluçkaya yatırıyoruz ve Ca2+ ‘daki kademeli artış hücre hasarına neden olmaktan kaçınıyor7. İzole kardiyomiyositler sağlam olduğu sürece (kasılma olmayan sessiz hücreler) bu Ca2+adaptasyon prosedürü farelerde hücre canlılığını etkilemez. Bu kuluçka sırasında hasarlı hücreler ölürken, sonuç olarak sağlıklı bir hücre grubu elde ediyoruz. Benzer şekilde, izole edilmiş sağlam atriyal miyositler (düzensiz kasılma olmadan sessiz hücreler) aynı hücre resüspenzyon çözeltisinde saklanabilir. Bununla birlikte, atriyal miyositler ventrikül miyositlerine kıyasla depolanmaları daha hassas olma eğilimindedir.
Laboratuvarda, sol ventrikül içine iğne yerleştirilmesi başarısız olmadıkça bu izolasyon yöntemi hemen hemen her zaman başarılıdır. Cerrahi enine aort daralması ile hazırlanan hipertrofik kalpten hücreleri izole etmede de başarılı olduk. Bununla birlikte, genellikle küçük miyokard enfarktüslerine sahip olan yaşlı farelerde, perfüzyon bazı yerlerde durur, bu da eksik sindirime ve dolayısıyla Langendorff tabanlı retrograd yöntemine benzer şekilde düşük verime (Şekil 1C) neden olursa. Bu gibi durumlarda, kalbin çarpık şekli perfüzyon başlangıcında bile gözlenebilir.
Bu antegrad perfüzyon yöntemi, kalp hücrelerini çeşitli yaşlardaki farelerden izole etmek için yararlıdır, ancak tavşan ve kobaylar gibi daha büyük hayvanlardan izole etmek için yararlıdır. Bu yöntemin weaning’den önce yenidoğan veya genç sıçanlara uygulanması mümkün olabilir.
Bu antegrad perfüzyon yönteminin avantajlarından biri, küçük fare kalpleri için Langendorff tabanlı retrograd perfüzyon yönteminin kullanılmasıyla ilgili teknik engelleri azaltmasıdır. Perfüzyon için gereken süre enzimlerin 10 mL’si ile yaklaşık 7 dakikadır, bu kısa sindirim süresi hücrelerin canlılığını arttırır. Ek olarak, perfüzyonun aort kapakları sindirildikten sonra bile kalbin koroner dolaşımı yoluyla gerçekleştirililmesini sağlar. Atriyal miyositlerin izolasyonu genellikle Langendorff bazlı retrograd perfüzyon ve enzimlerle daha fazla inkübasyon gerektirir17. Bununla birlikte, bu antegrad perfüzyon yaklaşımı, atriyal miyositleri izole etmek için dokuyu enzimle derinlemesine perfüzyonlayabilir.
Birden fazla farenin kullandığı deneylerde, Langendorff aparatı bir sonraki kalbe perfüzyondan önce temizlenmelidir. Bununla birlikte, mevcut antegrade yönteminde, istenen sayıda alet seti (örneğin şırınga iğneleri ve perfüzyon plakaları) önceden hazırlandığı sürece perfüzyon sürekli olarak yapılabilir.
Burada, ek kimyasallar olmadan Langendorff tabanlı retrograd perfüzyon yöntemiyle aynı çözümleri kullanarak fare kalbinin antegrad perfüzyonunun temel metodolojisini rapor ediyoruz. Perfüzyonun bileşimi, hücreden çıkarılanmış bir kalp yapmak için enzimler yerine EGTA içeren bir deterjan kullanmak gibi deneyin amacına uyacak şekilde değiştirilebilir18.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, morfolojik deneylerdeki yardımları için T. Yamamoto ve Y. Mori’ye teşekkür ediyor. Bu çalışma, Japonya Bilimi Destekleme Derneği’nden (18K06871’den M.O.K.’ye ve 17K08536’dan H.M.’ye) Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibesi (C) ile desteklendi.
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |