우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.
마우스 심장을 이용한 기본 연구에서실행 가능한 개별 심근세포를 격리하는 것은 극복해야 할 중요한 기술적 단계입니다. 전통적으로 토끼, 기니 피그 또는 쥐로부터 심근구를 분리하는 것은 랑엔도르프 장치를 사용하여 효소로 심장의 역행 적 정류를 통해 수행되었습니다. 그러나 이 방법을 작은 마우스 심장과 함께 사용할 때 높은 수준의 기술이 필요합니다. 랑엔도르프 장치를 사용하지 않는 영양 관류 방법은 최근에 마우스 심근세포의 분리를 위해 보고되었다. 본 명세서에서는 성숙한 마우스(8-108주 이전)로부터 개별 심장 세포를 분리하기 위해 절제된 심장의 개선된 영양 배분 관류에 대한 완전한 프로토콜을 보고합니다. 영양 관류는 소비 펌프를 사용하여 절제된 심실의 좌심실 의 정점 근처에 퍼서브를 주입하여 수행됩니다. 모든 절차는 현미경의 밑에 미리 온온히터 매트에 수행됩니다, 이는 주입 및 관류 과정을 감시할 수 있습니다. 결과는 심실 과 심방 심근 세포, 그리고 섬유 아세포가 동시에 단 하나 성인 마우스에서 잘 격리될 수 있다는 것을 건의합니다.
일반적으로, 해부된 조직의 단일 세포 격리의 첫 번째 단계는 조직을 작은 조각으로 잘라내고, 결합 조직 및 효소를 가진 세포외 매트릭스의 소화를 포함한다. 그러나, 심근세포는 콜라겐과 엘라스틴 섬유를 포함한 세포외 매트릭스 성분으로 농축되어 심근을 다진 것이 너무 힘들게 만들고, 심근세포는 저산소증 및 마이크로 환경의 다른 변화에 매우 민감하기 때문에 이러한 도마로 격리될 수 없다. 따라서, 랑엔도르프 계열 역행 관혈 시스템1을이용하여, 효소로 세포외 매트릭스를 소화하는 방법이 심장2,3,4로부터개별 심근세포를 분리하도록 개발되었다.
마우스 모델에서, 랑엔도르프 계의 역행성 심혼은 또한 개별 심근세포의 분리를 위해 이용된다5,6,7,8. 그러나, 작고 얇은 마우스 대어와 그 장착은 성상 심혼에 있는 대어타의 직경이 약 1.2mm이기 때문에, 역행성 perfusion을 수행하기 위하여 Langendorff 장치에 설치하는 기술의 높은 정도를 요구합니다. 또한 랑엔도르프 장치를 세척한 후 다음 심장을 침전시키기 전에 여러 실험을 수행하는 데 시간이 걸립니다.
역행 관류의 대안으로, 랑엔도르프 장치없이 성인 마우스 심장에서 심근구를 분리하는 새로운 방법이 개발되었다. 이 획기적인 제조 방법은 관상 동맥9의영양 가혈을 기반으로하였다. 최근에대마의 클램핑, 바늘 삽입, 온도 조절 등 이 격급 프로토콜의 각 단계를 개선하고현미경(10)으로모든 관류 절차를 모니터링했다. 본 원에서 이 선고성 관류 방법의 정제를 상세히 보고하여 격리 시간을 단축하고 추가 비디오를 제공합니다. 이 방법에서, 심혼의 관류는 효소의 10 mL를 가진 대략 7 분 소요되고, 이 짧은 소화 기간은 세포의 생존도를 증가시킵니다. 이는 2,3-부탄단 단축(BDM)6,11 또는 타우린5,8과같은 화학물질의 첨가를 요구하지 않고 고품질로 단일 심장 세포를 격리하는 간단한 방법입니다. 우리는이 방법은 기술의 기술 임계 값을 낮추고 기본 연구에서 마우스 심근 세포의 유용성을 향상시킬 것이라고 믿습니다.
심장은 허혈에 매우 취약하기 때문에, 심장을 소비하고 수축을 중지 얼음 차가운 CIB-EGTA에 몰입하는 데 걸리는 시간은 가능한 한 짧게 유지되어야한다 (<1 분). 이 메서드의 첫 번째 중요 단계입니다. 두 번째 중요한 단계는 마음의 방향에 관한 것입니다. 단계 2.1.2에서 절제 된 심장의 특정 방향은 대어타 주위의 지방 및 결합 조직을 쉽게보고 제거 할 수 있습니다. 대금반 주위를 청소한 후, 고정된 심장을 앞쪽 표면면을 관류판에 올려 놓습니다. 마지막 중요한 단계는 주입 바늘의 삽입을 관련시킵니다. 바늘을 심장쪽으로 전진할 때, 주사 바늘은 플레이트로부터 일정한 거리를 유지하기 위해 관류 판에서 분리되어서는 안된다. 삽입의 위치는 좌심실의 정점 근처에 있습니다. 이러한 비틀림이 구멍을 확대 할 수 있기 때문에, 비틀지 않고 조심스럽게 바늘을 삽입합니다. 바늘의 삽입의 깊이는 빨간 자국을 보고 추정될 수 있다. 바늘이 너무 깊게 삽입되면 팁은 심실 중격을 관통하고 오른쪽 심실을 입력하거나 승모 판막이 있지만 왼쪽 아트리움에 들어갈 수 있습니다. 관상 동맥에서 혈액의 실종을 확인 한 후, 바늘은 관류 판에 테이프로 고정해야합니다.
대오르타 길이가 길어지면 대어를 올바른 위치에 고정하기가 어렵습니다. 클램프가 심장에서 너무 멀리 떨어져 있으면, 심혼은 주입 후 회전할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 바로 brachiocephalic 동맥 아래에 대동맥을 잘라 클램핑 하기 전에 대동맥을 단축.
혈액이 0.5 mL /min의 초기 속도로 관류 후 배출되기 시작하지 않으면 속도를 1 mL /min로 증가시킵니다. 도움이 되지 않는 경우, 주사 바늘은 오른쪽 심실, 심실 중격 또는 왼쪽 심근 벽과 같이 잘못 배치될 수 있다. 이러한 경우 바늘을 즉시 제거하고 왼쪽 심실의 정점 근처에 다시 삽입하십시오. 바늘을 여러 번 삽입할 때 소화된 세포가 열린 구멍에서 흘러나올 수 있습니다. 이것은 일반적으로 세포 격리에 심각한 영향을 미치지 않습니다.
연산자는 스테레오스코픽 현미경을 사용하여 심장의 영양 관류의 전체 과정을 모니터링하여 소화와 함께 아트리아의 구타의 색상과 투명성의 변화를 관찰할 수 있습니다. 효소 믹스의 총 10 mL는 오래된 심장에 대해서도 필요한 최대여야합니다. 젊은 마음 (5-7 주 이전)에서, 우리는 동일한 효소 믹스와 역행 관류를 통해 접근 과 유사한 9 mL로 볼륨을 감소시다.
최종 원심분리기의 상신제는 파편, 혈액세포 및 비심낭세포를 포함하는 반면, 펠릿에는 주로 심근세포와 섬유아세포 및 내피세포와 같은 비심세포오염이 포함되어 있습니다. 심근세포를 정화하려면 더 많은 단계가 필요합니다. 일반적으로 펠릿은 적절한 세포 배양 배지에서 재주중단되고 조직 세포 배양 접시에 37°C에서 2시간 동안 준비한 다음 배양에 대한 파이펫팅 및 준비로 심근세포를 부드럽게 제거해야 한다.
효소 믹스는 Ca2+ (0.3 mMM)의 낮은 농도를 포함합니다. 따라서 우리는 CIB-Ca2+-BSA (1.2 mMM Ca2+)에서소화 된 세포를 배양하고 세포 회수 용액 (1.8 mMCa2 +)으로최종 재발 방지 전에 Ca2 +의 점진적 증가는 세포 손상을 유발하는 것을방지합니다 7. 고립 된 심근세포가 손상되지 않는 한 (수축이없는 정지 세포)이 Ca2 +적응 절차는 마우스의 세포 생존가능성에 영향을 미치지 않습니다. 손상된 세포가 이 잠복기 도중 정지하고 있기 때문에, 우리는 결과적으로 건강한 세포 단을 얻습니다. 유사하게, 절연된 심방 심근세포(불규칙한 수축 이없는 퀼트 세포)는 동일한 세포 회수 용액에 저장될 수 있다. 그러나, 심방 심근세포는 심실 심근세포에 비해 저장되는 것이 더 섬세해 경향이 있다.
실험실에서, 이 격리 방법은 왼쪽 심실에 바늘 삽입이 실패하지 않는 한 거의 항상 성공적이다. 우리는 또한 외과 횡방향 대동맥 수축에 의해 준비된 비대성 심혼에서 세포를 격리하는 것을 성공했습니다. 그러나, 종종 작은 심근 경색이 있는 숙성 마우스에서는, 관류는 어떤 장소에서 중단되고, 불완전한 소화의 결과로, 따라서 낮은 수율(그림 1C),Langendorff 기지를 둔 역행 방법과 유사합니다. 이러한 경우, 관류의 시작에도 심장의 왜곡된 모양을 관찰할 수 있다.
이 영양 관류 방법은 토끼와 기니 피그와 같은 다양한 연령대의 쥐에서 심장 세포를 분리하는 데 유용합니다. 이 방법을 신생아 또는 청소년 쥐에 적용 하기 전에 수 있습니다.
이 선행 관류 방법의 장점 중 하나는 작은 마우스 하트에 대한 Langendorff 기반 역행 관류 방법을 사용하는 것과 관련된 기술적 장애물을 감소시키는 것입니다. 관류에 필요한 시간은 효소의 10mL로 약 7 분이며,이 짧은 소화 기간은 세포의 생존가능성을 증가시킵니다. 또한 대동맥 판막이 소화된 후에도 심혼의 관상 동맥 순환을 통해 관전을 수행할 수 있습니다. 심방 근세포의 격리는 일반적으로 랑엔도르프 기반역성 역행 성 관류및효소(17)를가진 추가 배양을 필요로 한다. 그러나 이 영양 배후 접근법은 심방 근구를 분리하는 효소로 조직을 깊이 침투시킬 수 있습니다.
여러 마우스를 사용한 실험에서 랑엔도르프 장치는 다음 심장을 침투하기 전에 세척해야 합니다. 그러나, 본 선급방법에서는, 원하는 수의 계측기 세트(예를 들어, 주사기 바늘 및 관류 판)가 사전에 제조되는 한, 관류는 지속적으로 수행될 수 있다.
본 명세서에서는 추가 화학물질이 없는 랑엔도르프 계 역행 관류 방법과 동일한 솔루션을 사용하여 마우스 심장의 선행 관류의 기본 방법론을 보고합니다. 멸부의 조성물은 세포탈화된심장(18)을만들기 위해 효소 대신 EGTA를 함유하는 세제를 사용하는 등의 실험의 목적에 맞게 변경될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 태야마모토와 Y. 모리가 형태학적 실험에 도움을 준 것에 대해 감사를 표합니다. 이 작품은 과학진흥을 위한 일본학회(18K06871~M.O.K., 17K08536~H.M.)의 과학연구보조금(C)에 의해 지원되었다.
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |