Abbiamo sviluppato un metodo semplicie per isolare le singole cellule cardiache del topo di alta qualità con la tecnica della perfusione antegrada. Questo metodo è privo di Langendorff e utile per isolare miociti ventricolari e atriali o cellule interstiziali, come fibroblasti cardiaci o progenitori.
Nella ricerca di base che utilizza il cuore del topo, isolare i cardiomiociti individuali vitali è un passo tecnico cruciale da superare. Tradizionalmente, l’isolamento dei cardiomiociti da conigli, porcellini d’India o ratti è stato eseguito tramite perfusione retrograda del cuore con enzimi utilizzando un apparato di Langendorff. Tuttavia, è necessario un alto grado di abilità quando questo metodo viene utilizzato con un piccolo cuore di topo. Un metodo di perfusione pregrada che non utilizza un apparato di Langendorff è stato recentemente segnalato per l’isolamento dei cardiomiociti del topo. Nel presente documento viene indato un protocollo completo per una migliore perfusione antegrada del cuore asportato per isolare le singole cellule cardiache dai topi adulti (8 – 108 settimane). La perfusione antegrada viene eseguita iniettando perfusato vicino all’apice del ventricolo sinistro del cuore asportato, la cui aorta è stata bloccata, utilizzando una pompa per infusione. Tutte le procedure vengono eseguite su un tappetino riscaldante preri riscaldato al microscopio, che consente di monitorare i processi di iniezione e perfusione. I risultati suggeriscono che i miociti ventricolari e atriali e i fibroblasti possono essere ben isolati contemporaneamente da un singolo topo adulto.
Generalmente, il primo passo dell’isolamento a singola cellula del tessuto sezionato comporta la macinata del tessuto in piccoli pezzi, seguita dalla digestione del tessuto connettivo e dalla matrice extracellulare con enzimi. Tuttavia, i cardiomiociti non possono essere isolati con un tale metodo di taglio, poiché l’arricchimento con componenti della matrice extracellulare, comprese le fibre di collagene ed elastina, rende il miocardio troppo resistente alla tritacanza e i cardiomiociti sono altamente sensibili all’ipossia e ad altri cambiamenti nel microambiente. Pertanto, utilizzando il sistema di perfusione retrograda a base di Langendorff1, è stato sviluppato un metodo per digerire la matrice extracellulare con enzimi per isolare i singoli cardiomiociti dal cuore2,3,4.
Nei modelli di topo, la perfusione retrograda del cuore a base di Langendorff con enzimi viene utilizzata anche per l’isolamento dei singoli cardiomiociti5,6,7,8. Tuttavia, la cannulazione dell’aorta del topo piccola e sottile e il suo montaggio sull’apparato di Langendorff per eseguire la perfusione retrograda richiedono un alto grado di abilità, poiché il diametro dell’aorta nel cuore adulto è di circa 1,2 mm. Inoltre, ci vuole tempo per eseguire più esperimenti poiché l’apparato di Langendorff deve essere pulito prima di perfondere il cuore successivo.
In alternativa alla perfusione retrograda, è stato sviluppato un nuovo metodo per isolare i cardiomiociti da un cuore adulto di topo senza un apparato di Langendorff. Questo metodo epocale si basava sulla perfusione antegrada delle arterie coronarie9. Recentemente abbiamo migliorato ogni fase di questo protocollo antegrado, come il bloccaggio dell’aorta, l’inserimento dell’ago e il controllo della temperatura, e monitorato tutte le procedure di perfusione con unmicroscopio 10. Nel presente documento viene fornito un dettaglio del perfezionamento di questo metodo di perfusione antegrada per ridurre i tempi di isolamento e fornire un video supplementare. In questo metodo, la perfusione del cuore richiede circa 7 minuti con 10 mL degli enzimi e questo breve periodo di digestione aumenta la vitalità delle cellule. Questo è un metodo semplice per isolare le cellule monocuore ad alta qualità senza richiedere l’aggiunta di sostanze chimiche, come 2,3-butanedione monoxime (BDM)6,11 o taurina5,8. Crediamo che questo metodo alimenterà la soglia di abilità della tecnica e migliorerà l’utilità dei cardiomiociti del topo nella ricerca di base.
Poiché il cuore è altamente suscettibile all’ischemia, il tempo necessario per asportare il cuore e immergerlo nel CIB-EGTA ghiacciato per fermare la contrazione deve essere tenuto corto il più possibile (<1 min). Questo è il primo passaggio critico di questo metodo. Il secondo passo critico riguarda la direzione del cuore. Il particolare orientamento del cuore asportato nella fase 2.1.2 rende più facile vedere e rimuovere il grasso e i tessuti connettivi intorno all'aorta. Dopo aver pulito intorno all'aorta, posizionare il cuore bloccato con il lato anteriore della superficie sulla piastra di perfusione. Il passaggio critico finale prevede l'inserimento dell'ago di iniezione. Quando si avanza l'ago verso il cuore, l'ago di iniezione non deve essere staccato dalla piastra di perfusione per mantenere una distanza costante dalla piastra. La posizione dell'inserimento è vicina all'apice del ventricolo sinistro. Inserire l'ago con attenzione senza torcere, poiché tale torsione può ingrandire il foro. La profondità dell'inserimento dell'ago può essere stimata guardando il segno rosso. Se l'ago viene inserito troppo in profondità, la punta può perforare attraverso il setto ventricolare ed entrare nel ventricolo destro o attraverso la valvola mitrale ed entrare nell'atrio sinistro. Dopo aver confermato la scomparsa del sangue dall'arteria coronarica, l'ago deve essere fissato con nastro adesivo alla piastra perfusionale.
Una lunghezza dell’aorta più lunga rende difficile bloccare l’aorta nella posizione giusta. Se il morsetto è troppo distante dagli atri, il cuore può ruotare dopo infusione perfusata. Per evitare ciò, tagliare l’aorta appena sotto l’arteria brachiocefalica per accorciare l’aorta prima del bloccaggio.
Se il sangue non inizia a scaricarsi dopo la perfusione ad una velocità iniziale di 0,5 mL/min, aumentare la velocità a 1 mL/min. Se ciò non aiuta, l’ago di iniezione può essere posizionato in modo errato, ad esempio nel ventricolo destro, nel setto ventricolare o nella parete miocardica sinistra. In tal caso, rimuovere immediatamente l’ago e provare a inserirlo di nuovo vicino all’apice del ventricolo sinistro. Quando si inserisce l’ago più volte, le cellule digerite possono fuoriescono dai fori aperti. Si noti che questo di solito non influisce seriamente sull’isolamento della cella.
Gli operatori possono monitorare l’intero processo di perfusione antegrada del cuore utilizzando un microscopio stereoscopico per osservare i cambiamenti di colore e trasparenza e riavviare il battito degli atri insieme alla digestione. Un totale di 10 mL di miscela enzimatica dovrebbe essere il massimo richiesto, anche per un vecchio cuore. Nei cuori più giovani (5-7 settimane), riduciamo il volume a 9 mL, che è simile all’approccio tramite perfusione retrograda con lo stesso mix enzimatico.
Il supernatante alla centrifugazione finale contiene detriti, cellule del sangue e non miociti mentre, il pellet contiene principalmente cardiomiociti e non miociti contaminanti, come fibroblasti e cellule endoteliali. Per purificare i cardiomiociti, sono necessari più passaggi. In generale, il pellet deve essere risosopendato nel mezzo di coltura cellulare appropriato e prepiato per 2 ore a 37 °C su un piatto di coltura di cellule tissutali, quindi rimuovere delicatamente i cardiomiociti pipettando e preplating per la coltura.
La miscela enzimatica contiene una bassa concentrazione di Ca2+ (0,3 mM). Incubamo quindi cellule digerite in CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2+)prima della resuspensione finale con la soluzione di resopensione cellulare (1,8 mM Ca2+),e il graduale aumento di Ca2+ evita di causare danni allecellule 7. Finché i cardiomiociti isolati sono intatti (cellule quiescenti senza contrazione) questa procedura di adattamento Ca2+non influisce sulla vitalità cellulare nei topi. Poiché le cellule danneggiate stanno morendo durante questa incubazione, di conseguenza otteniamo un gruppo cellulare sano. Allo stesso modo, i miociti atriali intatti isolati (cellule quiescenti senza contrazione irregolare) possono essere conservati nella stessa soluzione di risospensione cellulare. Tuttavia, i miociti atriali tendono ad essere più delicati da archiviare rispetto ai miociti ventricolari.
In laboratorio, questo metodo di isolamento ha quasi sempre successo a meno che l’inserimento dell’ago nel ventricolo sinistro non fallisca. Siamo anche riusciti a isolare le cellule dal cuore ipertrofico preparato dalla costrizione aortica trasversale chirurgica. Tuttavia, nei topi invecchiati, che spesso hanno piccoli infarti miocardi, la perfusione cessa in alcuni punti, con conseguente digestione incompleta e quindi una bassa resa (Figura 1C), simile al metodo retrogrado a base di Langendorff. In questi casi, la forma distorta del cuore può essere osservata anche all’inizio della perfusione.
Questo metodo di perfusione pregrada è utile per isolare le cellule cardiache da topi di varie età ma non animali più grandi, come conigli e porcellini d’India. Potrebbe essere possibile applicare questo metodo ai ratti neonatale o giovanile prima dello svezzamento.
Uno dei vantaggi di questo metodo di perfusione pregrada è che riduce gli ostacoli tecnici associati all’utilizzo del metodo di perfusione retrograda a base di Langendorff per i cuori di topo piccolo. Il tempo necessario per la perfusione è di circa 7 minuti con 10 mL degli enzimi, questo breve periodo di digestione aumenta la vitalità delle cellule. Inoltre, consente di eseguire la perfusione attraverso la circolazione coronarica del cuore, anche dopo che le valvole aortiche sono state digerite. L’isolamento dei miociti atriali di solito richiede una perfusione retrograda a base di Langendorff e un’ulteriore incubazione con enzimi17. Questo approccio perfusione antegrado, tuttavia, può perfondere profondamente il tessuto con l’enzima per isolare i miociti atriali.
Negli esperimenti che utilizzano più topi, l’apparato di Langendorff deve essere pulito prima di perfondere il cuore successivo. Tuttavia, nell’attuale metodo antegrado, purché il numero desiderato di set di strumenti (ad esempio, aghi per siringhe e piastre perfusionali) sia preparato in anticipo, la perfusione può essere eseguita continuamente.
Nel presente documento viene presentata la metodologia di base della perfusione antegrada del cuore del topo utilizzando le stesse soluzioni del metodo di perfusione retrograda a base di Langendorff senza sostanze chimiche aggiuntive. La composizione del perfusato può essere modificata in base allo scopo dell’esperimento, come l’uso di un detergente contenente EGTA al posto degli enzimi per fare un cuore decellularizzato18.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano T. Yamamoto e Y. Mori per la loro assistenza negli esperimenti morfologici. Questo lavoro è stato supportato da un Grant-in-Aid for Scientific Research (C) della Japan Society for the Promotion of Science (da 18K06871 a M.O.K. e 17K08536 a H.M.).
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |