我们开发了一种通过前代灌注技术分离高质量个体小鼠心脏细胞的简化e方法 。这种方法是无兰根多夫和有用的隔离心室和心室肌细胞或间质细胞,如心脏成纤维细胞或祖先。
在使用小鼠心脏的基础研究中,分离可行的单个心肌细胞是需要克服的关键技术步骤。传统上,通过使用兰根多夫装置逆行灌注心脏与酶,将心肌细胞与兔子、豚鼠或大鼠隔离开来。然而,当使用这种方法与小老鼠的心脏时,需要高度的技能。最近报告了一种不使用兰根多夫装置的前体灌注方法,用于分离小鼠心肌细胞。我们在这里报告一个完整的协议,为改善前体灌注切除的心脏,以隔离从成年小鼠的个别心脏细胞(8 – 108周大)。前体灌注通过在切除心脏左心室的顶点附近注射灌注来进行,使用输液泵夹住主动脉。所有程序均在显微镜下预热加热垫上进行,从而可以监测注射和灌注过程。结果表明,心室和心室肌细胞和成纤维细胞可以同时从一只成年小鼠中分离出来。
一般来说,解剖组织的单细胞分离的第一步是将组织细分成小块,然后消化结缔组织和细胞外基质与酶。然而,心肌细胞不能用这种切碎方法进行分离,因为富集细胞外基质成分,包括胶原蛋白和弹性纤维,使心肌太硬,无法切碎,心肌细胞对缺氧和微环境的其他变化高度敏感。因此,利用基于兰根多夫的逆行灌注系统1,开发出一种用酶消化细胞外基质的方法,将单个心肌细胞从心脏分离出来2、3、4。
在小鼠模型中,基于兰根多夫的逆行灌注心脏与酶也用于隔离个别心肌细胞5,6,7,8。然而,小而细的老鼠主动脉的及其安装在兰根多夫装置上进行逆行灌注需要高度的技巧,因为成人心脏主动脉的直径约为 1 . 2 毫米。此外,它需要时间来执行多个实验,因为兰根多夫仪器应该清洗之前,香水的下一个心脏。
作为逆行灌注的替代方案,开发出一种无需兰根多夫装置的新型方法,将心肌细胞从成年小鼠心脏中分离出来。这种划时代的方法是基于冠状动脉9的前部灌注。我们最近改进了这个前科协议的每一步,如主动脉夹紧、针插入和温度控制,并用显微镜10监测所有灌注程序。我们在这里详细报告这种前体灌注方法的改进,以缩短隔离时间,并提供补充视频。在这种方法中,心脏的灌注大约需要7分钟,酶的10mL,这个短暂的消化周期增加了细胞的生存能力。这是一个简单的方法,隔离单一心脏细胞的高质量,而无需添加化学物质,如2,3-丁二醇单xime (BDM)6,11或陶林5,8.我们相信,这种方法将降低该技术的技术门槛,提高小鼠心肌细胞在基础研究中的效用。
由于心脏极易缺血,因此应尽可能缩短切除心脏并将其浸入冰冷的 CIB-EGTA 以阻止收缩所花的时间(< 1 分钟)。这是该方法的第一个关键步骤。第二个关键步骤涉及心脏的方向。第 2.1.2 步切除心脏的特殊方向使主动脉周围的脂肪和结缔组织更容易看到和去除。在主动脉周围清洁后,将夹紧的心脏与前表面侧面放在灌注板上。最后的关键步骤是插入注射针。当将针头推向心脏时,注射针不应与灌注板分离,以保持与心脏的恒定距离。插入的位置靠近左心室的顶点。小心插入针头而不扭曲,因为这种扭曲可能会扩大孔。通过观察红色标记,可以估计插入针头的深度。如果针头插入太深,尖端可能会穿透心室隔膜,进入右心室或通过手套瓣进入左中庭。确认冠状动脉血液消失后,针头应用胶带固定到灌注板上。
更长的主动脉长度使得很难将主动脉夹在正确的位置。如果夹子离阿特里亚太远,心脏可能会在灌注后旋转。为了防止这种情况,切断胸动脉下的主动脉,以缩短主动脉,然后夹紧。
如果血液在灌注后未以 0.5 mL/min 的初始速度开始排出,则将速度提高到 1 mL/min。如果这没有帮助,注射针头可能定位不正确,如在右心室,心室隔膜或左心肌壁。在这种情况下,立即取出针头,并尝试在左心室顶点附近重新插入针头。多次插入针头时,消化的细胞可能会从开孔流出。请注意,这通常不会严重影响细胞分离。
操作员可以使用立体显微镜监测心脏前体灌注的整个过程,观察颜色和透明度的变化,并重新启动阿提亚的跳动以及消化。总共10mL的酶混合物应该是最大的要求,即使是对于一个老心脏。在年轻的心脏(5-7周大),我们减少体积到9 mL,这是类似于通过逆行灌注与相同的酶混合的方法。
最终离心处的超分子含有碎片、血细胞和非细胞,而颗粒主要含有心肌细胞和污染物,如成纤维细胞和内皮细胞。为了净化心肌细胞,需要更多的步骤。一般来说,颗粒应在适当的细胞培养介质中重新喷出,并在组织细胞培养盘上预镀2小时,在37°C时,然后通过管道和预镀培养物轻轻去除心肌细胞。
酶混合物含有低浓度的Ca 2+(0.3 mM)。因此,我们用细胞悬念溶液(1.8 mM Ca2+)在CIB-Ca 2+-BSA(1.2 mM Ca2+)中孵育消化细胞,Ca2+的逐渐增加可避免造成细胞损伤7。只要分离的心肌细胞完好无损(没有收缩的静止细胞),这个Ca2+适应程序不会影响小鼠的细胞生存能力。由于受损细胞在潜伏期间死亡,因此我们获得了一个健康的细胞群。同样,分离的完整心室肌细胞(未不规则收缩的静止细胞)可以存储在同一细胞悬念溶液中。然而,与心室肌细胞相比,心室肌细胞的存储往往更加微妙。
在实验室中,除非插入左心室的针头发生故障,否则这种隔离方法几乎总是成功的。我们还成功地将细胞从手术横向主动脉收缩准备的超营养心脏中分离。然而,在老年小鼠中,经常有小心肌梗塞,灌注在一些地方停止,导致消化不全,从而产生低产量(图1C),类似于兰根多夫的逆行方法。在这种情况下,即使在灌注开始时也能观察到心脏扭曲的形状。
这种前额灌注方法有助于将心脏细胞与不同年龄但较大的动物(如兔子和豚鼠)隔离开来。在断奶之前,有可能将这种方法应用于新生儿或幼鼠。
这种前体灌注方法的优点之一是,它减少了与使用基于兰根多夫的逆行灌注法为小老鼠心脏相关的技术障碍。灌注所需的时间约为7分钟,酶为10mL,这种短暂的消化期增加了细胞的生存能力。此外,它使灌注通过心脏的冠状动脉循环进行,即使在主动脉瓣被消化后。心肌细胞的分离通常需要兰根多夫为基础的逆行灌注和进一步孵化与酶17。然而,这种前体灌注方法可以用酶深入灌注组织,以分离心肌细胞。
在使用多个小鼠的实验中,兰根多夫装置应在注入下一颗心脏之前进行清洁。然而,在目前的前代方法中,只要事先准备了所需的仪器套数(如注射针和灌注板),就可以连续进行灌注。
我们这里报告小鼠心脏前体灌注的基本方法,使用与兰根多夫为基础的逆行灌注法相同的解决方案,没有额外的化学物质。香水的成分可以改变,以适应实验的目的,如使用含有EGTA的洗涤剂,而不是酶,使一个减细胞的心脏18。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢山本和森喜朗在形态学实验中的帮助。这项工作得到了日本科学促进协会(18K06871至M.O.K.和17K08536至H.M)的科学研究资助(C)的支持。
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |