Мы разработалиупрощенный метод выделения высококачественных отдельных клеток сердца мыши с помощью метода антеградной перфузии. Этот метод не содержит Лангендорфа и полезен для выделения желудочковых и предсердных миоцитов или интерстициальных клеток, таких как сердечные фибробласты или прародители.
В фундаментальных исследованиях с использованием сердца мыши выделение жизнеспособных отдельных кардиомиоцитов является важным техническим шагом для преодоления. Традиционно выделение кардиомиоцитов из кроликов, морских свинок или крыс проводилось с помощью ретроградной перфузии сердца ферментами с использованием аппарата Лангендорфа. Тем не менее, высокая степень мастерства требуется, когда этот метод используется с маленьким мышеным сердцем. Недавно сообщалось о методе антеградной перфузии, который не использует аппарат Лангендорфа для выделения кардиомиоцитов мыши. Здесь мы сообщаем о полном протоколе улучшенной антеградной перфузии иссеченного сердца для выделения отдельных клеток сердца от взрослых мышей (8 – 108 недель). Антеградную перфузию проводят путем введения перфусата вблизи вершины левого желудочка иссеченного сердца, аорту которого зажимали, с помощью инфузионного насоса. Все процедуры проводятся на предварительно подогретом нагревательном коврике под микроскопом, что позволяет контролировать процессы инъекций и перфузии. Результаты показывают, что желудочковые и предсердные миоциты, а также фибробласты могут быть хорошо выделены от одной взрослой мыши одновременно.
Как правило, первый этап выделения одноклеточной рассеченной ткани включает измельчение ткани на мелкие кусочки с последующим перевариванием соединительной ткани и внеклеточного матрикса ферментами. Однако кардиомиоциты нельзя выделить таким методом измельчения, так как обогащение компонентами внеклеточного матрикса, включая коллагеновые и эластиновые волокна, делает миокард слишком жестким для измельчения, а кардиомиоциты очень чувствительны к гипоксии и другим изменениям микросреды. Так, с помощью ретроградной перфузионной системы 1 наосновеЛангендорфа был разработан метод переваривания внеклеточного матрикса ферментами для выделения отдельных кардиомиоцитов из сердца2,3,4.
В мышиных моделях ретроградная перфузия сердца на основе Лангендорфа с ферментами также используется для выделения отдельных кардиомиоцитов5,6,7,8. Однако канюляция маленькой и тонкой мышиной аорты и ее установка на аппарат Лангендорфа для выполнения ретроградной перфузии требует высокой степени мастерства, так как диаметр аорты во взрослом сердце составляет примерно 1,2 мм. Кроме того, требуется время для выполнения нескольких экспериментов, так как аппарат Лангендорфа должен быть очищен перед перфузией следующего сердца.
В качестве альтернативы ретроградной перфузии был разработан новый метод выделения кардиомиоцитов из сердца взрослой мыши без аппарата Лангендорфа. Этот эпохальный метод был основан на антеградной перфузии коронарных артерий9. Недавно мы улучшили каждый шаг этого протокола антеграда, такой как зажим аорты, введение иглы и контроль температуры, и контролировали все процедуры перфузии с помощью микроскопа10. Здесь мы подробно сообщаем об усовершенствовании этого метода антеградной перфузии, чтобы сократить время изоляции и предоставить дополнительное видео. При этом методе перфузия сердца занимает примерно 7 мин с 10 мл ферментов, и этот короткий период пищеварения повышает жизнеспособность клеток. Это простой метод выделения одиночных клеток сердца при высоком качестве, не требуя добавления химических веществ, таких как 2,3-бутанедион моноксим(БДМ) 6,11 или таурин5,8. Мы считаем, что этот метод снизит порог мастерства методики и повысит полезность мышиных кардиомиоцитов в фундаментальных исследованиях.
Поскольку сердце очень восприимчиво к ишемии, время, необходимое для иссечения сердца и погружения его в ледяной CIB-EGTA для остановки сокращения, должно быть как можно короче (<1 мин). Это первый критический шаг этого метода. Второй критический шаг касается направления сердца. Особая ориентация иссеченного сердца на этапе 2.1.2 облегчает просмотр и удаление жира и соединительных тканей вокруг аорты. После очистки вокруг аорты поместите зажатое сердце передней стороной поверхности вверх на перфузионную пластину. Последний критический этап включает в себя введение инъекционной иглы. При продвижении иглы к сердцу инъекционная игла не должна отделяться от перфузионной пластины, чтобы поддерживать постоянное расстояние от пластины. Положение вставки находится вблизи вершины левого желудочка. Вставляйте иглу осторожно, не скручивая, так как такое скручивание может увеличить отверстие. Глубину введения иглы можно оценить, наблюдая за красной меткой. Если игла вставлена слишком глубоко, наконечник может проткнуть желудочковую перегородку и войти в правый желудочек или через митральный клапан и войти в левое предсердие. После подтверждения исчезновения крови из коронарной артерии иглу следует закрепить скотчем к перфузионной пластине.
Более длинная длина аорты затрудняет зажим аорты в правильном положении. Если зажим находится слишком далеко от предсердий, сердце может вращаться после инфузии перфусата. Чтобы предотвратить это, отрежьте аорту прямо под брахиоцефальной артерией, чтобы укоротить аорту перед зажатием.
Если кровь не начинает отступать после перфузии с начальной скоростью 0,5 мл/мин, увеличьте скорость до 1 мл/мин. Если это не помогает, инъекционная игла может быть расположена неправильно, например, в правом желудочке, перегородке желудочков или левой стенке миокарда. В таком случае немедленно извлеките иглу и попробуйте повторно вставить ее возле вершины левого желудочка. При введении иглы несколько раз переваренные клетки могут вытекать из открытых отверстий. Обратите внимание, что это обычно не оказывает серьезного влияния на изоляцию клеток.
Операторы могут контролировать весь процесс антеградной перфузии сердца с помощью стереоскопического микроскопа, чтобы наблюдать изменения цвета и прозрачности и перезапуск биения предсердий вместе с пищеварением. В общей сложности 10 мл ферментной смеси должны быть максимально необходимыми, даже для старого сердца. В молодых сердцах (5-7 недель) мы уменьшаем объем до 9 мл, что аналогично подходу через ретроградную перфузию с той же смесью ферментов.
Супернатант при конечной центрифугировании содержит мусор, клетки крови и немиоциты, тогда как гранула содержит в основном кардиомиоциты и загрязняющие немиоциты, такие как фибробласты и эндотелиальные клетки. Чтобы очистить кардиомиоциты, необходимо больше шагов. В общем, гранулу следует повторно суспендировали в соответствующей среде клеточного культивирования и предварительно наносили в течение 2 ч при 37°С на чашку для культуры клеток ткани, а затем осторожно удалять кардиомиоциты путем пипетирования и предварительного покрытия для культивирования.
Ферментная смесь содержит низкую концентрацию Ca2+ (0,3 мМ). Поэтому мы инкубируем переваренные клетки в CIB-Ca2+-BSA (1,2 мМ Ca2+)перед окончательным повторным суспензией раствором для повторного суспензии клеток (1,8 мМ Ca2+),и постепенное увеличение Ca2+ позволяет избежать повреждения клеток7. До тех пор, пока изолированные кардиомиоциты неповреждены (покоящиеся клетки без сокращения), эта процедура адаптации Ca2+не влияет на жизнеспособность клеток у мышей. Поскольку поврежденные клетки умирают во время этой инкубации, мы, следовательно, получаем здоровую группу клеток. Аналогичным образом, изолированные интактные предсердные миоциты (покоятся клетки без нерегулярного сокращения) могут храниться в том же растворе для ресуспензии клеток. Тем не менее, предсердные миоциты, как правило, более деликатны для хранения по сравнению с желудочковыми миоцитами.
В лаборатории этот метод изоляции почти всегда успешен, если только введение иглы в левый желудочек не дает сбоя. Нам также удалось изолировать клетки из гипертрофированного сердца, полученные хирургическим поперечным сужением аорты. Однако у пожилых мышей, у которых часто возникают небольшие инфаркты миокарда, перфузия прекращается в некоторых местах, что приводит к неполному пищеварению и, следовательно, низкому выходу(рисунок 1С),аналогично ретроградный метод на основе Лангендорфа. В таких случаях искаженная форма сердца может наблюдаться даже в начале перфузии.
Этот метод антеградной перфузии полезен для выделения клеток сердца у мышей разного возраста, но не от более крупных животных, таких как кролики и морские свинки. Возможно, удастся применить этот метод к неонатальным или молодым крысам перед отлучением от отлучения от детей.
Одним из преимуществ этого метода антеградной перфузии является то, что он уменьшает технические препятствия, связанные с использованием метода ретроградной перфузии на основе Лангендорфа для маленьких мышечных сердец. Время, необходимое для перфузии, составляет примерно 7 мин с 10 мл ферментов, этот короткий период пищеварения повышает жизнеспособность клеток. Кроме того, он позволяет проводить перфузию через коронарную циркуляцию сердца, даже после того, как аортальные клапаны были переварены. Выделение предсердных миоцитов обычно требует ретроградной перфузии на основе Лангендорфа и дальнейшей инкубации с ферментами17. Этот антеградный перфузионный подход, однако, может глубоко перфузить ткань ферментом для выделения предсердных миоцитов.
В экспериментах с использованием нескольких мышей аппарат Лангендорфа следует очистить перед перфузией следующего сердца. Однако в настоящем антеградном способе, если желаемое количество наборов инструментов (например, иглы для шприцев и перфузионных пластин) приготовлено заранее, перфузию можно выполнять непрерывно.
Здесь мы сообщаем основную методологию антеградной перфузии сердца мыши с использованием тех же растворов, что и метод ретроградной перфузии на основе Лангендорфа без дополнительных химических веществ. Состав перфусата может быть изменен в соответствии с целью эксперимента, например, с использованием моющего средства, содержащего EGTA, вместо ферментов для создания децеллюляризованного сердца18.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Т. Ямамото и Ю. Мори за помощь в морфологических экспериментах. Эта работа была поддержана грантом на научные исследования (C) от Японского общества содействия науке (18K06871 для M.O.K. и 17K08536 для H.M.).
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |