פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.
במחקר בסיסי באמצעות לב העכבר, בידוד קרדיומיוציטים בודדים קיימא הוא צעד טכני חיוני להתגבר. באופן מסורתי, בידוד קרדיומיוציטים מארנבים, שרקנים או חולדות בוצע באמצעות זלוף מדרדר של הלב עם אנזימים באמצעות מנגנון Langendorff. עם זאת, רמה גבוהה של מיומנות נדרשת כאשר שיטה זו משמשת עם לב עכבר קטן. שיטת זלוף antegrade שאינו משתמש במנגנדורף מנגנון דווח לאחרונה לבידוד של קרדיומיוציטים העכבר. אנו מדווחים בזאת פרוטוקול מלא עבור זלוף antegrade משופר של הלב שנכרת כדי לבודד תאי לב בודדים מעכברים בוגרים (8 – 108 שבועות). זלוף Antegrade מבוצע על ידי הזרקת perfusate ליד השיא של החדר השמאלי של הלב שנכרת, שאב העורקים של אשר היה מהודק, באמצעות משאבת עירוי. כל ההליכים מתבצעים על מחצלת תנור מחוממת מראש תחת מיקרוסקופ, המאפשרת ניטור של תהליכי ההזרקה והזלוף. התוצאות מראות כי מיוציטים חדריים ואקבריים, ופיברובלסטים יכולים להיות מבודדים היטב מעכבר בוגר יחיד בו זמנית.
בדרך כלל, הצעד הראשון של בידוד תא יחיד של רקמה מנותחת כרוך טחון הרקמה לחתיכות קטנות, ואחריו העיכול של רקמת החיבור מטריצה חוץ תאית עם אנזימים. עם זאת, לא ניתן לבודד קרדיומיוציטים בשיטת חיתוך כזו, שכן העשרה ברכיבי מטריצה חוץ-תאית, כולל סיבי קולגן ואלסטין, הופכת את שריר הלב לקשה מדי לטחון, והקרדיומיוציטים רגישים מאוד להיפוקסיה ולשינויים אחרים במיקרו-וירוס. לכן, באמצעות מערכת זלוף מדרדר מבוסס Langendorff1, שיטה לעיכול המטריצה חוץ תאית עם אנזימים פותחה כדי לבודד קרדיומיוציטים בודדים מהלב2,3,4.
בדגמי עכבר, זלוף מדרדר מבוסס Langendorff של הלב עם אנזימים משמש גם לבידוד של קרדיומיוציטים בודדים5,6,7,8. עם זאת, הכנרת של סיומת העכבר הקטנה והדקה וההרכבה שלה על מנגנון לנגנדורף לביצוע זלוף מדרדר דורשת רמה גבוהה של מיומנות, שכן קוטר העורקים בלב הבוגר הוא כ -1.2 מ”מ. יתר על כן, זה לוקח זמן לבצע ניסויים מרובים כמו מנגנון Langendorff יש לנקות לפני זלוף הלב הבא.
כחלופה זלוף מדרדר, שיטה חדשנית לבידוד cardiomyocytes מלב עכבר בוגר ללא מנגנון Langendorff פותחה. שיטה זו לייצור עידן התבססה על זלוף אנגרד של העורקים הכליליים9. לאחרונה שיפרנו כל שלב בפרוטוקול antegrade זה, כגון הידוק של העורקים, החדרת מחט ובקרת טמפרטורה, וניטרנו את כל הליכי הזלוף במיקרוסקופ10. אנו מדווחים בפירוט על עידון שיטת זלוף זו כדי לקצר את זמן הבידוד ולספק סרטון משלים. בשיטה זו, זלוף הלב לוקח בערך 7 דקות עם 10 מ”ל של האנזימים, ותקופת עיכול קצרה זו מגבירה את הכדאיות של התאים. זוהי שיטה פשוטה לבודד תאי לב בודדים באיכות גבוהה ללא צורך בתוספת של כימיקלים, כגון 2,3-butanedione monoxime (BDM)6,11 או טאורין5,8. אנו מאמינים כי שיטה זו תוריד את סף המיומנות של הטכניקה ולשפר את התועלת של קרדיומיוציטים העכבר במחקר בסיסי.
מאז הלב רגיש מאוד איסכמיה, הזמן לקח כדי excise את הלב לטבול אותו CIB-EGTA קר כקרח כדי לעצור התכווצות צריך להישמר קצר ככל האפשר (<1 דקות). זהו השלב הקריטי הראשון בשיטה זו. הצעד הקריטי השני נוגע לכיוון הלב. האוריינטציה המסוימת של הלב שנכרת בשלב 2.1.2 מקלה על הצפייה וההסרה של רקמות השומן והחיבור סביב העורקים. לאחר ניקוי סביב העורקים, מניחים את הלב מהודק עם צד משטח לפנים על צלחת זלוף. השלב הקריטי האחרון כרוך החדרת מחט ההזרקה. בעת קידום המחט לכיוון הלב, מחט ההזרקה לא צריכה להיות מנותקת מצלחת הזלוף על מנת לשמור על מרחק קבוע מהצלחת. מיקום ההכנסה קרוב לשיא החדר השמאלי. הכנס את המחט בזהירות מבלי לסובב, שכן פיתול כזה עשוי להגדיל את החור. ניתן להעריך את עומק החדרת המחט על ידי צפייה בסימן האדום. אם המחט מוכנסת עמוק מדי, הקצה עשוי לנקב דרך מחיצת החדר ולהיכנס לחדר הימני או אם כי השסתום המיטרלי ולהיכנס לאטריום השמאלי. לאחר אישור היעלמות הדם מהקורק הכלילי, יש לתקן את המחט עם סרט הדבקה ללוחית הזלוף.
אורך ארוך יותר של העורקים מקשה על הידק של העורקים בתנוחה הנכונה. אם המהדק רחוק מדי מן האטריה, הלב עשוי להסתובב לאחר עירוי זלוף. כדי למנוע זאת, לחתוך את העורקים רק מתחת לעורק brachiocephalic כדי לקצר את כאבי העורקים לפני ההידוק.
אם הדם לא מתחיל לפרוק לאחר זלוף במהירות ראשונית של 0.5 מ”ל / דקה, להגדיל את המהירות ל 1 מ”ל / דקה. אם זה לא עוזר, מחט ההזרקה עשויה להיות ממוקמת באופן שגוי, כגון בחדר הימני, מחיצה חדרית או קיר שריר הלב השמאלי. במקרה כזה, להסיר את המחט מיד ולנסות להכניס אותו מחדש ליד השיא של החדר השמאלי. בעת החדרת המחט מספר פעמים, תאים מתעכלים עשויים לזרום החוצה מן החורים שנפתחו. שים לב כי זה בדרך כלל לא משפיע ברצינות על בידוד התא.
המפעילים יכולים לפקח על כל התהליך של זלוף antegrade של הלב באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי כדי לבחון את השינויים בצבע ושקיפות והפעלה מחדש של מכות האטריה יחד עם העיכול. סך של 10 מ”ל של תערובת אנזימים צריך להיות המקסימום הנדרש, אפילו עבור לב ישן. בלבבות צעירים יותר (5-7 שבועות), אנו מפחיתים את הנפח ל 9 מ”ל, אשר דומה לגישה באמצעות זלוף מדרדר עם אותו תערובת אנזימים.
supernatant בצנטריפוגה הסופית מכיל פסולת, תאי דם, ולא מיוציטים ואילו, גלולה מכיל בעיקר cardiomyocytes וזיהום שאינם מיוציטים, כגון fibroblasts ותאי אנדותל. כדי לטהר את הקרדיומיוציטים, יש צורך בצעדים נוספים. באופן כללי, גלולה צריך להיות resuspended במדיום תרבות התא המתאים preplated במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס על צלחת תרבית תא רקמה, ולאחר מכן בעדינות להסיר את cardiomyocytes על ידי pipetting ו preplating לתרבות.
תערובת האנזימים מכילה ריכוז נמוך של Ca2+ (0.3 מ”מ). לכן אנו דגירה תאים מתעכלים CIB-Ca2 +-BSA (1.2 mM Ca2+) לפני ההשעיה הסופית עם פתרון ההשעיה מחדש של התא (1.8 mM Ca2+), ואת הגידול ההדרגתי Ca2+ נמנע גרימת נזק לתא7. כל עוד הקרדיומיוציטים המבודדים שלמים (תאים רגיעה ללא התכווצות) הליך התאמה זה של Ca2+אינו משפיע על הכדאיות של התאים בעכברים. כמו התאים הפגועים מתים במהלך דגירה זו, אנו מקבלים כתוצאה מכך קבוצת תאים בריאה. באופן דומה, מיוציטים פרוזדוריים שלמים מבודדים (תאים רגיעה ללא התכווצות לא סדירה) ניתן לאחסן באותו פתרון ההשעיה מחדש של התא. עם זאת, myocytes הפרוזדורי נוטים להיות עדינים יותר כדי להיות מאוחסן להשוות את myocytes חדרית.
במעבדה, שיטת בידוד זו היא כמעט תמיד מוצלחת אלא אם כן החדרת המחט לחדר השמאלי נכשלת. הצלחנו גם לבודד תאים מהלב hypertrophied שהוכן על ידי התכווצות אבי העורקים רוחבית כירורגית. עם זאת, בעכברים מיושנים, שלעתים קרובות יש להם אוטם שריר לב קטן, הזלוף נפסק במקומות מסוימים, וכתוצאה מכך עיכול לא שלם ובכך תשואה נמוכה (איור 1C), בדומה לשיטת הנסיגה המבוססת על לנגנדורף. במקרים כאלה, ניתן לראות את הצורה המעוותת של הלב גם בתחילת הזחילה.
שיטת זלוף antegrade זו שימושית לבידוד תאי לב מעכברים בגילאים שונים אך לא מבעלי חיים גדולים יותר, כגון ארנבות ושפני ניסיונות. ייתכן שניתן יהיה ליישם שיטה זו על חולדות יילודים או נוער לפני התיישנות.
אחד היתרונות של שיטת זלוף antegrade זה הוא שזה מקטין את המכשולים הטכניים הקשורים באמצעות שיטת זלוף מדרדר מבוסס Langendorff עבור לבבות עכבר קטנים. הזמן הנדרש עבור זלוף הוא כ 7 דקות עם 10 מ”ל של האנזימים, תקופת עיכול קצרה זו מגבירה את הכדאיות של התאים. בנוסף, הוא מאפשר זלוף להתבצע באמצעות זרימת הדם הכלילית של הלב, גם לאחר שסתומי אבי העורקים כבר מתעכל. בידוד של מיוציטים פרוזדוריים בדרך כלל דורש זלוף מדרדר מבוסס Langendorff ודגרת נוספת עםאנזימים 17. גישה זו זלוף antegrade, עם זאת, יכול להחדיר עמוק את הרקמה עם האנזים כדי לבודד מיוציטים פרוזדוריים.
בניסויים באמצעות עכברים מרובים, יש לנקות את מנגנון לנגנדורף לפני שהוא מחלחל ללב הבא. עם זאת, בשיטת antegrade הנוכחית, כל עוד המספר הרצוי של ערכות מכשירים (למשל, מחטי מזרקים וצלחות זלוף) מוכנים מראש, זלוף יכול להתבצע ברציפות.
אנו מדווחים בזאת על המתודולוגיה הבסיסית של זלוף אנגרד של לב העכבר באמצעות אותם פתרונות כמו שיטת זלוף מדרדר מבוסס לנגנדורף ללא כימיקלים נוספים. ההרכב של perfusate ניתן לשנות כדי להתאים את מטרת הניסוי, כגון שימוש בחומר ניקוי המכיל EGTA במקום האנזימים כדי להפוך לב decellularized18.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לטי ימאמוטו וליורי על עזרתם בניסויים המורפוגליים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק בסיוע למחקר מדעי (C) מהחברה היפנית לקידום המדע (18K06871 ל M.O.K. ו 17K08536 ל H.M.).
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |