Формирование правильной саркомерной сети имеет важное значение для созревания кардиомиоцитов, полученных из iPSC. Мы представляем супер резолюции на основе подхода, который позволяет для количественной оценки структурного созревания стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов, для улучшения культурных условий содействия развитию сердца.
Созревание кардиомиоцитов, полученных из iPSC, является важнейшей проблемой для их применения в регенеративной терапии, тестировании на наркотики и моделировании заболеваний. Несмотря на разработку нескольких протоколов дифференциации, генерация кардиомиоцитов iPSC, напоминающих взрослый фенотип, остается сложной задачей. Одним из основных аспектов созревания кардиомиоцитов является формирование хорошо организованной сети саркомеров для обеспечения высокой мощности сжатия. Здесь мы представляем супер резолюции на основе подхода для полуколиченого анализа α в кардиомиоцитов. С помощью фотоактивированной микроскопии локализации проводилось сравнение длины саркомера и толщины z-диска кардиомиоцитов, полученных из iPSC, и сердечных клеток, изолированных от неонатальной ткани. В то же время мы демонстрируем важность надлежащих условий визуализации для получения достоверных данных. Наши результаты показывают, что этот метод подходит для количественного мониторинга структурной зрелости сердечных клеток с высоким пространственным разрешением, что позволяет выявлять даже тонкие изменения саркомерной организации.
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), такие как инфаркт миокарда или кардиомиопатия остаются основной причиной смерти в западном мире1. Поскольку человеческое сердце обладает лишь плохими регенеративными возможностями, существует необходимость в стратегиях содействия восстановлению после ССЗ. Это включает в себя заместительную терапию клеток для пополнения потерянных кардиомиоцитов (СМ), а также разработку новых антиаритмических препаратов для эффективного и безопасного фармацевтического вмешательства. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) были показаны, чтобы быть перспективным источником клеток для неограниченного поколения человека CM in vitro, подходит для регенеративной терапии, моделирования заболеваний, а также для развития скрининга наркотикованализы 2,3,4.
Хотя существует много различных протоколов сердечной дифференциации, сМ, полученных iPSC, по-прежнему не имеют определенных фенотипических и функциональных аспектов, которые препятствуют in vitro и in vivo application5,,6. Помимо электрофизиологических, метаболических и молекулярных изменений, процесс созревания сердца включает в себя структурную организацию сармеров, которые являются основными единицами, необходимыми для генерации силы исокращения клеток 7. В то время как взрослые CMs демонстрируют хорошо организованный контрактильный аппарат, СМ, полученные iPSC, обычно демонстрируют несовершенные саркомерные нити, связанные с пониженной способностью сжатия и измененнойдинамикой сокращения 8,9. В отличие от зрелых CM, которые показывают одноосную модель сокращения, дезориентированные структуры в незрелых CM приводит к радиальной сокращения всей клетки или способствовать появлению сокращениякоординационных центров 9,10.
Для улучшения созревания сердца, несколько подходов были применены, в том числе методы культуры 3D клеток, электрической и механической стимуляции, а также использование внеклеточных матриц имитирующих в условиях Виво11,12,13. Для оценки успеха и эффективности этих различных культурных условий необходимы методы мониторинга и оценки степени структурного созревания iPSC CM, например, с помощью микроскопических методов. В отличие от обычных конфокальных изображений, разрешение в случае фотоактивированной микроскопии локализации (PALM) примерно в 10 раз выше. Этот метод, в свою очередь, позволяет более точный анализ, обнаруживая даже тонкие изменения клеточных структур14. Учитывая высокое разрешение изображений на основе PALM, общей целью этого метода была микроскопическая оценка зрелости саркомера в CMs, полученных iPSC, путем точного определения толщины z-Disc и длины саркомера. В предыдущих исследованиях, эти структурные особенности были показаны, чтобы быть подходящими параметрами для оценки сердечнойзрелости 15. Например, больные iPSC-CM не хватает полной длины дистрофина экспонат снижение длины саркомера и z-диапазон ширина по сравнению с дикимиклетками типа 16. Аналогичным образом, длина отдельных сармеров была измерена для исследования влияния топографических сигналов на развитие сердца16. Поэтому мы применили этот подход для оценки структурного созревания саркомерной сети в iPSC-CM путем количественного измерения длины саркомера и толщины z-диска.
Поколение функциональных сМ в пробирке, полученных из iPSC, имеет важное значение для регенеративной терапии, моделирования заболеваний и разработки платформ скрининга лекарственных средств. Тем не менее, недостаточная зрелость этих СМ является основным препятствием в сердечно-сосуди?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано структурным фондом ЕС (ESF/14-BM-A55-0024/18). Кроме того, H.L. поддерживается программой FORUN Медицинского центра Ростокского университета (889001 и 889003) и Фондом Джозефа и Кёте Клинца (T319/29737/2017). C.I.L. поддерживается программой ученых-клиницистов Медицинского центра Ростокского университета. R.D поддерживается DFG (DA1296/6-1), фондом DAMP, Немецким фондом сердца (F/01/12) и BMBF (VIP-00240).
Мы благодарим Мадлен Барч за ее техническую поддержку в культуре клеток iPSC и сердечную дифференциацию.
human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
Fiji image processing software (Image J) | |||
Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |