De vorming van een goed sarcomerenetwerk is belangrijk voor de rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een super resolutie-gebaseerde aanpak die het mogelijk maakt voor de kwantitatieve evaluatie van de structurele rijping van stamcel afgeleide cardiomyocyten, ter verbetering van de cultuuromstandigheden ter bevordering van de ontwikkeling van het hart.
De rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten is een cruciaal probleem voor hun toepassing in regeneratieve therapie, drugstesten en ziektemodellering. Ondanks de ontwikkeling van meerdere differentiatieprotocollen blijft de generatie iPSC cardiomyocyten die lijken op een volwassen fenotype een uitdaging. Een belangrijk aspect van cardiomyocyten rijping omvat de vorming van een goed georganiseerd sarcomere netwerk om een hoge contractiecapaciteit te garanderen. Hier presenteren we een super resolutie-gebaseerde aanpak voor semi-kwantitatieve analyse van het α-actinin netwerk in cardiomyocyten. Met behulp van fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie werd een vergelijking gemaakt van de sarcomerelengte en de z-discdikte van iPSC-afgeleide cardiomyocyten en hartcellen geïsoleerd van neonatale weefsel. Tegelijkertijd tonen we het belang aan van goede beeldvormingsvoorwaarden om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Onze resultaten tonen aan dat deze methode geschikt is om de structurele rijpheid van hartcellen met een hoge ruimtelijke resolutie kwantitatief te monitoren, waardoor zelfs subtiele veranderingen van de sarcomere organisatie kunnen worden gedetecteerd.
Hart- en vaatziekten (CVD) zoals een hartinfarct of cardiomyopathie blijven de belangrijkste doodsoorzaak in de westerse wereld1. Aangezien het menselijk hart slechts een slechte regeneratieve capaciteit bezit, is er behoefte aan strategieën om het herstel van CVD’s te bevorderen. Dit omvat celvervangende therapieën om verloren cardiomyocyten (CM) aan te vullen, evenals de ontwikkeling van nieuwe antiritmische geneesmiddelen voor efficiënte en veilige farmaceutische interventie. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) zijn aangetoond dat een veelbelovende celbron voor de onbeperkte generatie van menselijke CM in vitro, geschikt voor regeneratieve therapieën, ziekte modellering, en voor de ontwikkeling van screening testen van geneesmiddelen2,3,4.
Hoewel er veel verschillende cardiale differentiatieprotocollen bestaan, ontbreekt het iPSC-afgeleide CM nog steeds aan bepaalde fenotypische en functionele aspecten die de in vitro en in vivo toepassing5,6belemmeren . Naast elektrofysiologische, metabolische en moleculaire veranderingen, omvat het hartrijpingsproces de structurele organisatie van sarcomeres, die de fundamentele eenheden zijn die nodig zijn voor krachtgeneratie en celcontractie7. Terwijl volwassen CMs een goed georganiseerd contractielapparaat vertonen, tonen door iPSC afgeleide CMs vaak ongeregelde sarcomerefilamenten aan, geassocieerd met een verminderd contractievermogen en veranderde contractiedynamiek8,9. In tegenstelling tot volwassen CM die eenaxial contractiepatroon vertonen, resulteren de gedesoriënteerde structuren in onrijpe CM in een radiale samentrekking van de hele cel of bevorderen de verschijning van contractie focal points9,10.
Voor het verbeteren van de hartrijping zijn meerdere benaderingen toegepast, waaronder 3D-celkweekmethoden, elektrische en mechanische stimulatie, evenals het gebruik van extracellulaire matrices die in vivo omstandigheden11,12,13nabootsen . Om het succes en de efficiëntie van deze verschillende cultuuromstandigheden te evalueren, zijn technieken nodig om de mate van structurele rijping van iPSC CM te monitoren en te schatten, bijvoorbeeld door middel van microscopische technieken. In tegenstelling tot conventionele confocale beeldvorming is de resolutie in het geval van fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) ongeveer 10x hoger. Deze techniek op zijn beurt zorgt voor een meer nauwkeurige analyse, het detecteren van zelfs subtiele veranderingen van cellulaire structuren14. Gezien de hoge resolutie van PALM-gebaseerde beeldvorming, het algemene doel van deze methode was de microscopische evaluatie van sarcomere rijpheid in iPSC-afgeleide CMs door nauwkeurige bepaling van z-Disc dikte en sarcomere lengte. In eerdere studies is aangetoond dat deze structurele kenmerken geschikte parameters zijn om cardiale rijpheid te beoordelen15. Bijvoorbeeld, zieke iPSC-CM ontbreekt volledige lengte dystrophin vertonen verminderde sarcomere lengte en z-band breedte in vergelijking met wilde type cellen16. Ook werd de lengte van individuele sarcomeres gemeten om de impact van topografische signalen op cardiale ontwikkeling16te onderzoeken. Daarom hebben we deze aanpak toegepast om de structurele rijping van het sarcomere-netwerk in iPSC-CM te evalueren door de sarcomerelengte en z-discdikte kwantitatief te meten.
De generatie van functionele iPSC-afgeleide CM in vitro is belangrijk voor regeneratieve therapieën, ziektemodellering en de ontwikkeling van drugscreeningplatforms. Echter, onvoldoende rijpheid van deze CM is een groot obstakel in cardiovasculair onderzoek20. In dit verband zijn beeldvormingstechnieken met hoge resolutie nodig die het mogelijk maken de structurele rijpingstoestand van iPSC-afgeleide CM te monitoren. Tegelijkertijd kan microscopie met superresolutie een waardevol hulpmiddel zijn …
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door het Structuurfonds van de EU (ESF/14-BM-A55-0024/18). Daarnaast wordt H.L. ondersteund door het FORUN Programma van het Rostock Universitair Medisch Centrum (889001 en 889003) en de Josef and Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017). C.I.L. wordt ondersteund door het Clinician Scientist Program van het Rostock University Medical Center. R.D wordt ondersteund door de DFG (DA1296/6-1), de DAMP foundation, de Duitse Hartstichting (F/01/12) en de BMBF (VIP+ 00240).
Wij danken Madeleine Bartsch voor haar technische ondersteuning in de iPSC celcultuur en hartdifferentiatie.
human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
Fiji image processing software (Image J) | |||
Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |