تشكيل شبكة ساركومير المناسبة مهم لنضوج القلب المشتق من iPSC. نقدم نهجًا فائقًا قائمًا على القرار يسمح بالتقييم الكمي للنضج الهيكلي للخلايا الجذعية المشتقة من خلايا القلب، لتحسين ظروف الثقافة التي تعزز تطور القلب.
نضوج القلب المشتق من iPSC هو قضية حاسمة لتطبيقها في العلاج التجديدي واختبار الأدوية وطراز الأمراض. على الرغم من تطوير بروتوكولات التمايز المتعددة ، فإن توليد عضلة القلب iPSC تشبه النمط الظاهري الشبيه بالراشد لا يزال صعبًا. أحد الجوانب الرئيسية لنضوج القلب و القلب ينطوي على تشكيل شبكة ساركومير منظمة تنظيما جيدا لضمان قدرة انكماش عالية. هنا، نقدم نهج فائقة القرار القائم على التحليل شبه الكمي لشبكة α actinin في cardiomyocytes. باستخدام المجهر التعريب photoactivated مقارنة طول السارومير وسمك القرص z من خلايا القلب المشتقة من iPSC والخلايا القلبية المعزولة عن أنسجة حديثي الولادة تم تنفيذها. في الوقت نفسه، نبرهن على أهمية ظروف التصوير المناسبة للحصول على بيانات موثوقة. تظهر نتائجنا أن هذه الطريقة مناسبة لمراقبة كمية النضج الهيكلي للخلايا القلبية ذات الدقة المكانية العالية ، مما يتيح الكشف عن التغيرات الدقيقة في تنظيم الساركومير.
أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) مثل احتشاء عضلة القلب أو اعتلال عضلة القلب لا تزال السبب الرئيسي للوفاة في العالم الغربي1. وبما أن قلب الإنسان لا يملك سوى ضعف القدرة التجديدية، هناك حاجة إلى استراتيجيات لتعزيز التعافي من الأمراض القلبية الوعائية. وهذا يشمل العلاجات استبدال الخلايا لتجديد خلايا القلب المفقودة (CM)، فضلا عن تطوير أدوية جديدة لمكافحة عدم انتظام النشاط التدخل الدوائي آمنة وفعالة. وقد تبين أن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) مصدر خلية واعدة للجيل غير محدود من CM الإنسان في المختبر، ومناسبة للعلاجات التجديدية، ونمذجة المرض، وتطوير فحص المخدرات المقايسات2،3،4.
على الرغم من وجود العديد من بروتوكولات تمايز القلب المختلفة ، لا يزال يوجد CM مشتق من iPSC بعض الجوانب الظاهرية والوظيفية التي تعوق المختبر وفي تطبيق vivo5،6. بجانب التغيرات الكهربية ، الأيضية ، والجزيئية ، تتضمن عملية نضوج القلب التنظيم الهيكلي للساركوميريات ، وهي الوحدات الأساسية المطلوبة لتوليد القوة وانكماش الخلايا7. في حين أن كبار CMs المعرض جهاز التعاقد منظمة تنظيما جيدا، وCMs المشتقة من iPSC عادة ما تظهر خيوط ساركومير غير مرتبة، المرتبطة انخفاض القدرة على الانكماش وتغيير ديناميات الانكماش8،9. على النقيض من درجة الحرارة الناضجة التي تظهر نمط انكماش uniaxial ، والهياكل مشوشة في نتائج CM غير ناضجة في تقلص شعاعي للخلية بأكملها أو تعزيز ظهور نقاط التركيز انكماش9،10.
لتحسين نضوج القلب، وقد تم تطبيق نهج متعددة، بما في ذلك 3D وسائل زراعة الخلايا، والتحفيز الكهربائي والميكانيكية، فضلا عن استخدام مصفوفات خارج الخلية محاكاة في ظروف الجسم الحي11،12،13. لتقييم نجاح وكفاءة هذه الظروف الثقافية المختلفة ، هناك حاجة إلى تقنيات لرصد وتقدير درجة النضج الهيكلي لـ iPSC CM ، على سبيل المثال ، عن طريق التقنيات المجهرية. على النقيض من التصوير confocal التقليدية، دقة في حالة المجهر تعريب مبطل ضوئي (بالم) هو ما يقرب من 10x أعلى. هذه التقنية بدورها تسمح لتحليل أكثر دقة، والكشف عن التعديلات حتى خفية من الهياكل الخلوية14. وبالنظر إلى الدقة العالية للتصوير القائم على النخلة، كان الهدف العام من هذه الطريقة هو التقييم المجهري لنضج الساروميري في CMS المشتقة من iPSC عن طريق التحديد الدقيق لسمك القرص z وطول الساركومير. في الدراسات السابقة، وقد تبين أن هذه السمات الهيكلية لتكون المعلمات المناسبة لتقييم نضج القلب15. على سبيل المثال، المرضى iPSC-CM تفتقر كامل طول ديستروفين معرض انخفاض طول الساركومير وعرض z-الفرقة بالمقارنة مع خلايا نوع البرية16. وبالمثل، تم قياس طول الساركوميريات الفردية للتحقيق في تأثير الإشارات الطبوغرافية على تطوير القلب16. ومن ثم، قمنا بتطبيق هذا النهج لتقييم النضج الهيكلي لشبكة ساركومير في iPSC-CM عن طريق قياس كمية طول الساركومير وسمك القرص z.
إن توليد CM المشتق من iPSC الوظيفي في المختبر مهم للعلاجات التجديدية ، والنمذجة المرض وتطوير منصات فحص المخدرات. ومع ذلك، النضج غير الكافي لهذه CM عقبة رئيسية في أبحاث القلب والأوعية الدموية20. وفي هذا الصدد، هناك حاجة إلى تقنيات تصوير عالية الدقة تمكن من رصد حالة النضج الهيكلي لـ …
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذه الدراسة الصندوق الهيكلي للاتحاد الأوروبي (ESF/14-BM-A55-0024/18). بالإضافة إلى ذلك، يتم دعم H.L. من قبل برنامج FORUN من المركز الطبي لجامعة روستوك (889001 و 889003) ومؤسسة جوزيف وكاثي كلينز (T319/29737/2017). ويدعم C.I.L. من قبل برنامج العلماء السريرية للمركز الطبي جامعة روستوك. ويدعم R.D من قبل DFG (DA1296/6-1)، ومؤسسة دامب، ومؤسسة القلب الألمانية (F/01/12) وBMBF (VIP+ 00240).
نشكر مادلين بارتش على دعمها الفني في ثقافة خلايا iPSC وتمايز القلب.
human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
Fiji image processing software (Image J) | |||
Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |