A formação de uma rede de sarcomere adequada é importante para o amadurecimento dos cardiomiócitos derivados do iPSC. Apresentamos uma abordagem baseada em super resolução que permite a avaliação quantitativa da maturação estrutural dos cardiomiócitos derivados de células-tronco, para melhorar as condições culturais que promovem o desenvolvimento cardíaco.
A maturação dos cardiomiócitos derivados do iPSC é uma questão crítica para sua aplicação em terapia regenerativa, testes medicamentosos e modelagem de doenças. Apesar do desenvolvimento de protocolos de diferenciação múltiplos, a geração de cardiomiócitos iPSC semelhantes a um fenótipo semelhante a um adulto permanece desafiadora. Um aspecto importante da maturação dos cardiomiócitos envolve a formação de uma rede de sarcomere bem organizada para garantir alta capacidade de contração. Aqui, apresentamos uma abordagem baseada em super resolução para análise semi-quantitativa da rede α-actinina em cardiomiócitos. Utilizando microscopia de localização fotoativada foi realizada uma comparação do comprimento do sarcomere e da espessura do disco z de cardiomiócitos derivados do iPSC e células cardíacas isoladas do tecido neonatal. Ao mesmo tempo, demonstramos a importância das condições adequadas de imagem para obter dados confiáveis. Nossos resultados mostram que este método é adequado para monitorar quantitativamente a maturidade estrutural das células cardíacas com alta resolução espacial, permitindo a detecção de até mesmo alterações sutis da organização sarcomere.
Doenças cardiovasculares (DCV) como infarto do miocárdio ou cardiomiopatia continuam sendo a principal causa de morte no mundo ocidental1. Como o coração humano possui apenas baixa capacidade regenerativa, há necessidade de estratégias para promover a recuperação dos DCV. Isso inclui terapias de substituição celular para repor cardiomiócitos perdidos (CM), bem como o desenvolvimento de novos medicamentos anti-arrítmicos para intervenção farmacêutica eficiente e segura. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) têm se mostrado uma fonte celular promissora para a geração ilimitada de CM humano in vitro, adequado para terapias regenerativas, modelagem de doenças e para o desenvolvimento de ensaios de rastreamento de medicamentos2,,3,4.
Embora existam muitos protocolos de diferenciação cardíaca diferentes, o CM derivado do iPSC ainda carece de certos aspectos fenotípicos e funcionais que impedem a aplicação in vitro e in vivo5,6. Além das alterações eletrofisiológicas, metabólicas e moleculares, o processo de maturação cardíaca envolve a organização estrutural dos sarcomeres, que são as unidades fundamentais necessárias para a geração de força e contração celular7. Enquanto os CMs adultos exibem um aparelho contratil bem organizado, os CMs derivados do iPSC comumente demonstram filamentos sarcomere desaranjados, associados a uma capacidade de contração reduzida e dinâmica de contração alterada8,,9. Em contraste com cm maduros que mostram padrão de contração uniaxial, as estruturas desorientadas em CM imaturos resultam em uma contração radial de toda a célula ou promovem o aparecimento dos pontos focais de contração9,,10.
Para melhorar a maturação cardíaca, foram aplicadas múltiplas abordagens, incluindo métodos de cultura celular 3D, estimulação elétrica e mecânica, bem como o uso de matrizes extracelulares imitando condições in vivo11,,12,,13. Para avaliar o sucesso e a eficiência dessas diferentes condições culturais, são necessárias técnicas para monitorar e estimar o grau de maturação estrutural do CM iPSC, por exemplo, por técnicas microscópicas. Em contraste com a imagem confocal convencional, a resolução em caso de microscopia de localização fotoativada (PALM) é aproximadamente 10x maior. Essa técnica, por sua vez, permite uma análise mais precisa, detectando até mesmo alterações sutis das estruturas celulares14. Considerando a alta resolução da imagem baseada em PALM, o objetivo geral deste método foi a avaliação microscópica da maturidade sarcomere em CMs derivados do iPSC por determinação precisa da espessura do disco z e do comprimento do sarcomere. Em estudos anteriores, essas características estruturais têm se mostrado parâmetros adequados para avaliar a maturidade cardíaca15. Por exemplo, iPSC-CM doente sem distrofina de comprimento total exibe comprimento reduzido de sarcomere e largura de banda z quando comparado com células do tipo selvagem16. Da mesma forma, o comprimento dos sarcomeres individuais foi medido para investigar o impacto das pistas topográficas no desenvolvimento cardíaco16. Assim, aplicamos essa abordagem para avaliar a maturação estrutural da rede sarcomere no iPSC-CM, medindo quantitativamente o comprimento do sarcomere e a espessura do disco Z.
A geração de CM in vitro derivada do iPSC funcional é importante para terapias regenerativas, modelagem de doenças e desenvolvimento de plataformas de rastreamento de medicamentos. No entanto, a maturidade insuficiente desses CM é um grande obstáculo na pesquisa cardiovascular20. Nesse sentido, são necessárias técnicas de imagem de alta resolução que permitam o monitoramento do estado de maturação estrutural do CM derivado do iPSC. Ao mesmo tempo, a microscopia de super resolução po…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado pelo Fundo Estrutural da UE (ESF/14-BM-A55-0024/18). Além disso, o H.L. é apoiado pelo Programa FORUN do Centro Médico da Universidade de Rostock (889001 e 889003) e pela Fundação Josef e Käthe Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. é apoiado pelo Programa de Cientistas Clínicos do Centro Médico da Universidade de Rostock. A R.D é apoiada pelo DFG (DA1296/6-1), pela fundação DAMP, pela Fundação Alemã do Coração (F/01/12) e pela BMBF (VIP+ 00240).
Agradecemos a Madeleine Bartsch por seu apoio técnico na cultura celular iPSC e diferenciação cardíaca.
human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
Fiji image processing software (Image J) | |||
Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |