形成适当的沙康网络对于 iPSC 衍生心肌细胞的成熟非常重要。我们提出了一种基于超分辨率的方法,允许对干细胞衍生心肌细胞的结构成熟进行定量评估,以改善促进心脏发育的培养条件。
iPSC衍生心肌细胞的成熟是它们在再生治疗、药物测试和疾病建模中应用的一个关键问题。尽管开发了多种分化方案,但类似成人表型的 iPSC 心肌细胞的生成仍然具有挑战性。心肌细胞成熟的一个主要方面是形成组织良好的沙科动物网络,以确保高收缩能力。在这里,我们提出了一种基于超分辨率的方法,用于对心肌细胞中α-actinin网络进行半定量分析。利用光激活定位显微镜,对从新生儿组织分离的 iPSC 衍生心肌细胞和心脏细胞的沙康长度和 z-disc 厚度进行了比较。同时,我们证明了适当的成像条件对于获得可靠数据的重要性。结果表明,该方法适合定量监测具有高空间分辨率的心脏细胞的结构成熟度,能够检测到沙康组织甚至细微的变化。
心血管疾病(CVD)(如心肌梗塞或心肌病)仍然是西方世界的主要死因。由于人类心脏只有不良的再生能力,因此需要制定战略来促进心血管疾病的恢复。这包括细胞替代疗法,以补充丢失的心肌细胞(CM),以及开发新的抗心律失常药物,以高效和安全的药物干预。诱导多能干细胞(iPSC)已被证明是一个有希望的细胞来源,无限代人类CM在体外,适合再生疗法,疾病建模,并用于药物筛选测定,2,3,43的发展。2
虽然存在许多不同的心脏分化协议,iPSC衍生的CM仍然缺乏某些表型和功能方面,阻碍体外和体内应用5,5,6。除了电生理、代谢和分子变化,心脏成熟过程涉及沙状物的结构组织,这是力生成和细胞收缩所需的基本单位。虽然成人CMs表现出组织良好的收缩装置,iPSC衍生的CMs通常表现出不一和的沙康丝,与收缩能力降低和改变收缩动力学8,8,9。与显示单轴收缩模式的成熟CM相比,未成熟CM中的迷失方向结构导致整个细胞的径向收缩或促进收缩焦点9、10,的出现。
为了改善心脏成熟,已经应用了多种方法,包括3D细胞培养方法,电和机械刺激,以及使用细胞外基质模仿体内条件11,12,13。11,12,13为了评估这些不同培养条件的成功和效率,需要技术来监测和估计 iPSC CM 的结构成熟程度,例如,通过微观技术。与传统共体成像相比,光激活定位显微镜 (PALM) 的分辨率高出约 10 倍。这种技术反过来允许更准确的分析,检测甚至微妙的变化的细胞结构14。考虑到PALM成像的高分辨率,该方法的总体目标是通过精确测定z-Disc厚度和沙康长度,对psC衍生的CMs中沙科勒成熟度进行微观评估。在以前的研究中,这些结构特征已被证明是评估心脏成熟度15的适当参数。例如,与野生细胞16相比,缺乏全长肌营养不良素的病症 iPSC-CM 表现出减少的沙康长度和 z 波段宽度。同样,测量单个沙形病的长度,以调查地形图线索对心脏发育的影响16。因此,我们运用这种方法对 iPSC-CM 中沙康器网络的结构成熟度进行了定量测量,从而测量了沙康卡长度和 z-disc 厚度。
体外功能 iPSC 衍生 CM 的生成对于再生疗法、疾病建模和药物筛选平台的发展非常重要。然而,这些CM的成熟度不足是心血管研究20的主要障碍。在这方面,需要高分辨率成像技术,以便监测 iPSC 衍生 CM 的结构成熟状态。同时,超分辨率显微镜可以是一个有价值的工具,可以精确分析特定蛋白质的功能,需要适当的沙康,最近证明的滴定和肌蛋白10,21,22。,<…
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了欧盟结构基金(ESF/14-BM-A55-0024/18)的支持。此外,H.L.还得到罗斯托克大学医学中心(889001和889003)和约瑟夫和克林茨基金会(T319/29737/2017)的 FORUN 方案的支持。C.I.L. 得到罗斯托克大学医学中心临床科学家计划的支持。R.D 由 DFG (DA1296/6-1)、DAMP 基金会、德国心脏基金会 (F/01/12) 和 BMBF (VIP+ 00240) 支持。
我们感谢玛德琳·巴奇在 iPSC 细胞培养和心脏分化方面给予的技术支持。
human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
Fiji image processing software (Image J) | |||
Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |