적절한 sarcomere 네트워크의 형성은 iPSC 유래 심근 세포의 성숙에 중요합니다. 우리는 줄기 세포 유래 심근세포의 구조적 성숙의 정량적 평가를 허용하고, 심장 발달을 촉진하는 배양 조건을 개선할 수 있는 슈퍼 분해능 기반 접근법을 제시한다.
iPSC 유래 심근세포의 성숙은 재생 치료, 약물 검사 및 질병 모델링에 있는 그들의 신청에 대한 중요한 문제점입니다. 다중 분화 프로토콜의 발달에도 불구하고 성인과 같은 표현형을 닮은 iPSC 심근세포의 생성은 여전히 도전적입니다. 심근 세포 성숙의 한 가지 주요 측면은 높은 수축 용량을 보장하기 위해 잘 조직 된 sarcomere 네트워크의 형성을 포함한다. 여기에서는 심근세포에서 α 액티닌 네트워크의 반정량 분석을 위한 슈퍼 분해능 기반 접근 방식을 제시합니다. 광활성화 국소화 현미경을 사용하여 신생아 조직으로부터 분리된 iPSC 유래 심근세포 및 심장 세포의 사코프레 길이 및 z-디스크 두께의 비교가 수행되었다. 동시에 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 적절한 이미징 조건의 중요성을 입증합니다. 우리의 결과는 이 방법이 높은 공간 해상도로 심장 세포의 구조적 성숙도를 정량적으로 모니터링하는 데 적합하다는 것을 보여 주어 sarcomere 조직의 미묘한 변화를 감지할 수 있습니다.
심근 경색 또는 심근병증과 같은 심혈관 질환(CVD)은 서구 세계1에서주요 사망 원인으로 남아 있다. 인간의 심장은 가난한 재생 능력을 가지고 있기 때문에, CVD에서 회복을 촉진하기위한 전략에 대한 필요가있다. 여기에는 분실된 심근세포(CM)를 보충하기 위한 세포 대체 요법뿐만 아니라 효율적이고 안전한 제약 개입을 위한 새로운 부정맥 약물의 개발이 포함됩니다. 유도만능 줄기세포(iPSC)는 생체외에서 인간 CM의 무제한 생성을 위한 유망한 세포공급원으로 나타났으며, 재생 요법, 질병 모델링, 약물 스크리닝 어세서2,,3,,4의개발에 적합하게 된다.
많은 다른 심장 분화 프로토콜이 존재하지만, iPSC 유래 CM은 여전히 시험관 내 및 생체 내 응용 프로그램5,,6을방해하는 특정 표현성 및 기능적 측면이 부족하다. 전기 생리학, 대사 및 분자 변화 외에도 심장 성숙 과정은 힘 생성 및 세포수축7에필요한 기본 단위인 sarcomeres의 구조 적 조직을 포함한다. 성인 CM은 잘 조직된 수축 장치를 전시하는 동안, iPSC 유래 CM은 일반적으로 수축 능력 감소 및 변경된 수축 역학과 관련된 분리된 사코레 필라멘트를 입증한다8,,9. 단축 수축 패턴을 보이는 성숙한 CM과는 달리, 미숙한 CM의 방향감각 구조는 전체 세포의 방사형 수축을 초래하거나 수축 초점점9,,10의출현을 촉진한다.
심장 성숙을 개선하기 위해 3D 세포 배양 방법, 전기 및 기계적 자극뿐만 아니라 생체 조건에서 모방된 세포외 행렬의사용(11,,12,13)을포함한 여러접근법이적용되었다. 이러한 다양한 배양 조건의 성공과 효율성을 평가하기 위해서는 미세한 기술로 iPSC CM의 구조적 성숙 정도를 모니터링하고 추정하기 위한 기술이 필요합니다. 기존의 공초점 영상과는 달리, 광활성화 국소화 현미경검사(PALM)의 경우 해상도는 약 10배 더 높다. 이 기술은 차례로 세포 구조물의 미묘한 변경을 검출하는 더 정확한 분석을 가능하게합니다(14). PALM 기반 이미징의 고해상도를 고려할 때, 이 방법의 전반적인 목표는 z-Disc 두께 및 사코메 길이의 정확한 측정에 의한 iPSC 유래 CM에서 sarcomere 성숙도의 현미경 평가였습니다. 이전 연구에서, 이러한 구조적 특징은 심장 성숙도를 평가하기 에 적합한 매개 변수로 표시되었습니다(15. 예를 들어, 병에 걸린 iPSC-CM전체 길이 디스트로핀이 부족한 경우 야생형세포(16)와비교했을 때 사코름 길이및 z대역 폭이 감소한다. 마찬가지로, 개별 사파레의 길이는 심장 발달에 지형 단서의 충격을 조사하기 위하여 측정되었다16. 따라서, 우리는 정량적으로 sarcomere 길이와 z 디스크 두께를 측정하여 iPSC-CM에서 sarcomere 네트워크의 구조적 성숙을 평가하기 위해이 접근 방식을 적용했다.
시험관 내 기능성 iPSC 유래 CM의 생성은 재생 치료, 질병 모델링 및 약물 선별 플랫폼의 개발에 중요합니다. 그러나, 이러한 CM의 불충분 한 성숙은 심장 혈관 연구에서 주요장애물이다 20. 이와 관련하여 iPSC 유래 CM의 구조적 성숙 상태를 모니터링할 수 있는 고해상도 이미징 기술이 필요합니다. 동시에, 슈퍼 분해능 현미경 검사는 최근 티틴 및,트로포닌(10,10<…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 EU 구조 기금 (ESF/14-BM-A55-0024/18)에 의해 지원되었다. 또한, H.L.은 로스토크 대학 의료 센터(889001 및 889003)와 요제프와 케테 클린츠 재단(T319/29737/2017)의 FORUN 프로그램에 의해 지원됩니다. C.I.L.은 로스토크 대학 의료 센터의 임상 과학자 프로그램에 의해 지원됩니다. R.D는 DFG(DA1296/6-1), DAMP 재단, 독일 심장 재단(F/01/12) 및 BMBF(VIP+ 00240)에 의해 지원됩니다.
우리는 iPSC 세포 배양및 심장 분화에 그녀의 기술 지원에 대한 마들렌 Bartsch 감사합니다.
human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
Fiji image processing software (Image J) | |||
Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |