JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/61166
, , , , ,
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine,Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine,Dartmouth College

Summary

Bu makale, beyin, omurilik ve meninksler dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi içindeki yerleşik ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerini incelemek için optimize edilmiş iki protokol sunmaktadır. Bu protokollerin her biri, kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında bu bölmeleri işgal eden hücrelerin işlevini ve bileşimini belirlemeye yardımcı olur.

Abstract

Merkezi sinir sistemi (MSS) beyin ve omurilikten oluşur ve çevre ile CNS arasında bir bariyer görevi gören zarlı tabakalar olan meninksler tarafından sarılır. CNS, immünolojik olarak uzmanlaşmış bir bölgedir ve kararlı durum koşullarında, bağışıklık ayrıcalığı en çok CNS parankiminde belirgindir. Buna karşılık, meninksler, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çok çeşitli yerleşik hücreler barındırır. CNS hasarı, otoimmünite, enfeksiyon ve hatta nörodejenerasyon ile tetiklenen enflamatuar durumlar sırasında, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri parankima girebilir ve meninksler içinde ikamet edebilir. Bu hücrelerin CNS hastalığı patogenezi sırasında hem yararlı hem de zararlı eylemler gerçekleştirdiği düşünülmektedir. Bu bilgiye rağmen, CNS bölmesini analiz ederken meninksler genellikle göz ardı edilir, çünkü geleneksel CNS doku ekstraksiyon yöntemleri meningeal tabakaları atlar. Bu protokol, tek hücreli teknikler, immünohistokimya ve in situ hibridizasyon yöntemleri ile aşağı akış analizi için uygun olan murin CNS dokularının (yani beyin, omurilik ve meninksler) hızlı izolasyonu için iki farklı yöntem sunar. Açıklanan yöntemler, homeostatik koşullar altında ve hastalık patogenezi sırasında CNS bölmesini işgal eden hücrelerin fenotipini, işlevini ve lokalizasyonunu değerlendirmek için ideal olan CNS dokularının kapsamlı bir analizini sağlar.

Introduction

Merkezi sinir sistemi (CNS) immünolojik olarak özelleşmiş bir bölgedir. CNS parankimi, BOS boşluğu, meninksler ve vaskülatür hariç, klasik olarak bağışıklık ayrıcalıklı bir bölge 1,2,3,4,5 olarak görülür ve homeostatik koşullar 2,6,7 sırasında nispeten bağışıklık hücrelerinden yoksundur. Buna karşılık, dura, araknoid ve pia tabakalarından oluşan meninksler, hastalık patogenezisırasında homeostatik immün sürveyans ve enflamatuar süreçlere aktif olarak katılan CNS bölmesinin önemli bileşenleridir 3,6,7,8. Kararlı durum koşulları sırasında, meninksler, doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC), makrofajlar, dendritik hücreler (DC), mast hücreleri, T hücreleri ve daha az ölçüde B hücreleri 9,10,11 dahil olmak üzere çok sayıda immün sentinel hücreyi destekler.

Meninksler oldukça vaskülarize yapılardır ve CNS ile çevresi arasında lenfatik bir bağlantı sağlayan lenfatik damarlar içerir 8,12,13,14. CNS hasarı, enfeksiyonlar, otoimmünite ve hatta nörodejenerasyonun neden olduğu enflamatuar durumlarda, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri parankimmaya sızar ve meninksler içindeki bağışıklık manzarasını değiştirir. Hücre infiltrasyonunu takiben, meninksler, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri için fonksiyonel bir nişi temsil edebilir, bağışıklık hücresi agregasyonunu, lokal bağışıklık hücresi aktivasyonunu ve CNS bölmesinde uzun süreli sağkalımı teşvik edebilir. Multipl skleroz (MS) dahil olmak üzere CNS’yi etkileyen birçok hastalıkta belirgin meningeal inflamasyon gözlenir.15,16,17,18,19, inme 20,21, steril yaralanma 22,23 (yani, omurilik yaralanması ve travmatik beyin hasarı), migren 24 ve mikrobiyal enfeksiyon 25,26,27,28,29. Bu nedenle, meningeal kompartmandaki yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş immün hücrelerin karakterizasyonu, bu hücrelerin kararlı durum koşulları ve hastalık patogenezi sırasındaki rolünü anlamak için gereklidir.

Kafatası ve omur gövdelerinden beyin, omurilik ve meninkslerin çıkarılması teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. Şu anda, üç meningeal tabakanın tümü bozulmadan beynin hızlı bir şekilde çıkarılması için herhangi bir teknik bulunmamaktadır. Laminektomi mükemmel omurilik dokusu morfolojisi sağlarken ve meningeal tabakaları korurken, hem son derece zaman alıcı hem de karmaşıktır30,31. Tersine, beynin kafatasından çıkarılması ve omuriliğin hidrolik ekstrüzyonu gibi daha geleneksel ekstraksiyon yöntemleri, CNS dokusunun hızlı bir şekilde çıkarılmasını kolaylaştırır, ancak bu tekniklerle hem araknoid hem de dural meninksler kaybolur30,31. Beyin ve omurilik dokularının konvansiyonel izolasyonu sırasında dura ve araknoid tabakaların ihmal edilmesi, CNS bölmesindeki hücrelerin eksik bir analizine neden olur. Bu nedenle, sağlam meninksli CNS dokularının hızlı ekstraksiyonuna odaklanan yeni tekniklerin tanımlanması, CNS bölmesinin optimal analizi için çok önemlidir.

Bu el yazması, farelerden beyin, omurilik ve meninkslerin hızlı bir şekilde çıkarılması için iki yöntem sunarak, CNS parankimi ve meninkslerinde yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerinin aşağı akış analizini kolaylaştırır. Bu optimize edilmiş protokoller, 1) aşağı akış analizi için tek hücreli süspansiyonların izole edilmesine ve 2) dokuların histolojik işleme için hazırlanmasına odaklanır. Beyinden, omurilik dokusundan ve dural ve araknoid meninkslerden tek hücreli süspansiyonların elde edilmesi32, hem parankimal hem de meningeal bölmelerde bulunan hücrelerin aynı anda analizine izin verir. Tek hücreli süspansiyonlar, in vitro stimülasyon 33, enzime bağlı immünospot (ELISpot)28,34,35, akış sitometrisi 36,33 ve tek hücreli 37 veya toplu transkriptomik gerçekleştirmek için hücre kültürü testleri dahil olmak üzere farklı uygulamalarda kullanılabilir. Ek olarak, sırasıyla sağlam kafatasları veya vertebral sütunlarla tüm beyinlerin ve omuriliklerin dekalsifikasyonu için optimize edilmiş protokol, meninksleri sağlam bırakarak ve doku morfolojisini koruyarak çevredeki kemiğin nazikçe dekalsifikasyonuna izin verir. Bu yöntem, hem parankimal hem de meningeal boşluklarda immünohistokimya (IHC) veya in situ hibridizasyon (ISH) teknikleri kullanılarak proteinlerin veya RNA’nın seçici olarak tanımlanmasına izin verir. CNS içindeki yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerinin fenotipinin, aktivasyon durumunun ve lokalizasyonunun karakterizasyonu, CNS bölmesindeki bireysel hücre tiplerinin homeostaz ve hastalık patogenezine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için gerekli bilgileri sağlayabilir.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları, Dartmouth’daki Geisel Tıp Okulu’ndaki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilen ve onaylanan protokolleri kullanır. 1. Dekalsifikasyon için beyin ve omurilik örneklerinin işlenmesi Beyin ve omurilik örneklerinin izole edilmesi Fareyi CO2 inhalasyonu yoluyla ötenazi yapın. CO2 akış hızının dakikada kafes hacminin -30’unu değiştirdiğinden emin ol…

Representative Results

Bu temsili deney, B ve T hücrelerini ölçmeyi ve homeostatik koşullarda meningeal ve parankimal CNS kompartmanlarında B ve T hücresi lokalizasyonunu tanımlamayı ve ayrıca bir murin progresif MS modelinde (yani, TMEV-IDD) tanımlamayı amaçladı. TMEV-IDD, 5 haftalık dişi SJL farelerinde, daha önce tarif edildiği gibi TMEV BeAn’ın 5 x 106 plak oluşturan birimi (PFU) ile intrakraniyal enfeksiyon ile indüklenmiştir29. Bu çalışmada, enfeksiyon…

Discussion

Homeostaz ve hastalık sırasında CNS bölmesindeki hücresel bileşimi değerlendirme yöntemleri, CNS’nin fizyolojik ve patolojik durumlarını anlamak için gereklidir. Bununla birlikte, CNS’de önemli bir bariyer görevi görmesine ve çeşitli bağışıklık hücrelerini barındırmasına rağmen, beyin ve omurilik için birçok geleneksel doku ekstraksiyon yöntemi bu zarların toplanmasına izin vermediğinden, meninksler genellikle analizden çıkarılır. Bu ihmal, meninkslerin hücresel bileşimi ve işlevi i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Dartmouth’daki Karşılaştırmalı Tıp ve Araştırma Merkezi (CCMR) personeline, bu çalışmalar için kullanılan farelere gösterdikleri uzman bakım için teşekkür eder. Bornstein Araştırma Fonu bu araştırmayı finanse etti.

Materials

Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler’s Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019)
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

MeningesImmune CellsSingle Cell AnalysisHistological MethodsMicrogliaAstrocytesPericytesEndothelial CellsStromal CellsNeuronsBrainSpinal CordDecalcificationSkull CapVertebrae Column

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image