JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Isoleren van weefsels van het centrale zenuwstelsel en bijbehorende hersenvliezen voor de downstream-analyse van immuuncellen

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/61166
, , , , ,
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine,Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine,Dartmouth College

Summary

Dit artikel presenteert twee geoptimaliseerde protocollen voor het onderzoeken van residente en perifeer afgeleide immuuncellen in het centrale zenuwstelsel, waaronder de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen. Elk van deze protocollen helpt bij het vaststellen van de functie en samenstelling van de cellen die deze compartimenten bezetten onder steady state en ontstekingsomstandigheden.

Abstract

Het centrale zenuwstelsel (CZS) bestaat uit de hersenen en het ruggenmerg en wordt omhuld door de hersenvliezen, vliezige lagen die dienen als een barrière tussen de periferie en het CZS. Het CZS is een immunologisch gespecialiseerde plaats en in steady state-omstandigheden is immuunprivilege het duidelijkst in het CZS-parenchym. Daarentegen herbergen de hersenvliezen een breed scala aan residente cellen, waaronder aangeboren en adaptieve immuuncellen. Tijdens ontstekingsaandoeningen veroorzaakt door CZS-letsel, auto-immuniteit, infectie of zelfs neurodegeneratie, kunnen perifeer afgeleide immuuncellen het parenchym binnendringen en hun intrek nemen in de hersenvliezen. Van deze cellen wordt gedacht dat ze zowel gunstige als schadelijke acties uitvoeren tijdens de pathogenese van de ziekte van het CZS. Ondanks deze kennis worden de hersenvliezen vaak over het hoofd gezien bij het analyseren van het CZS-compartiment, omdat conventionele CZS-weefselextractiemethoden de meningeale lagen weglaten. Dit protocol presenteert twee verschillende methoden voor de snelle isolatie van muizen CZS-weefsels (d.w.z. hersenen, ruggenmerg en hersenvliezen) die geschikt zijn voor downstream-analyse via eencellige technieken, immunohistochemie en in situ hybridisatiemethoden. De beschreven methoden bieden een uitgebreide analyse van CZS-weefsels, ideaal voor het beoordelen van het fenotype, de functie en de lokalisatie van cellen die het CZS-compartiment bezetten onder homeostatische omstandigheden en tijdens ziektepathogenese.

Introduction

Het centrale zenuwstelsel (CZS) is een immunologisch gespecialiseerde plaats. Het CZS-parenchym, met uitzondering van de CSF-ruimte, de hersenvliezen en de vasculatuur, wordt klassiek gezien als een immuunbevoorrechte plaats 1,2,3,4,5 en is relatief verstoken van immuuncellen tijdens homeostatische omstandigheden 2,6,7. Daarentegen zijn de hersenvliezen, bestaande uit de dura-, arachnoïde- en pialagen, cruciale componenten van het CZS-compartiment, die actief deelnemen aan homeostatische immuunsurveillance en ontstekingsprocessen tijdens ziektepathogenese 3,6,7,8. Tijdens steady state-omstandigheden ondersteunen de hersenvliezen talrijke immuunschildwachtcellen, waaronder aangeboren lymfoïde cellen (ILC), macrofagen, dendritische cellen (DC), mestcellen, T-cellen en in mindere mate B-cellen 9,10,11.

De hersenvliezen zijn sterk gevasculariseerde structuren en bevatten lymfevaten die zorgen voor een lymfatische verbinding tussen het CZS en de periferie 8,12,13,14. Bij ontstekingsaandoeningen veroorzaakt door CZS-letsel, infecties, auto-immuniteit of zelfs neurodegeneratie, infiltreren perifeer afgeleide immuuncellen het parenchym en veranderen het immuunlandschap in de hersenvliezen. Na celinfiltratie kunnen de hersenvliezen een functionele niche vormen voor perifeer afgeleide immuuncellen, waardoor immuuncelaggregatie, lokale immuuncelactivering en overleving op lange termijn in het CZS-compartiment worden bevorderd. Prominente meningeale ontsteking wordt waargenomen bij meerdere ziekten die het CZS beïnvloeden, waaronder multiple sclerose (MS) 15,16,17,18,19, beroerte 20,21, steriel letsel 22,23 (d.w.z. ruggenmergletsel en traumatisch hersenletsel), migraine 24 en microbiële infectie 25,26,27,28,29. De karakterisering van residente cellen en perifeer afgeleide immuuncellen in het meningeale compartiment is dus essentieel voor het begrijpen van de rol van deze cellen tijdens steady state-omstandigheden en ziektepathogenese.

De extractie van de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen uit de schedel en wervellichamen is technisch uitdagend en tijdrovend. Er zijn momenteel geen technieken beschikbaar voor de snelle extractie van de hersenen met alle drie de meningeale lagen intact. Hoewel laminectomie een uitstekende morfologie van het ruggenmergweefsel oplevert en de meningeale lagen behoudt, is het zowel extreem tijdrovend als gecompliceerd30,31. Omgekeerd vergemakkelijken meer conventionele extractiemethoden zoals de verwijdering van de hersenen uit de schedel en de hydraulische extrusie van het ruggenmerg de snelle extractie van het CZS-weefsel, maar zowel de arachnoïdale als durale hersenvliezen gaan verloren met deze technieken30,31. Het weglaten van dura- en arachnoïdelagen tijdens conventionele isolatie van hersen- en ruggenmergweefsels resulteert in een onvolledige analyse van de cellen in het CZS-compartiment. De identificatie van nieuwe technieken gericht op de snelle extractie van CZS-weefsels met intacte hersenvliezen is dus cruciaal voor de optimale analyse van het CZS-compartiment.

Dit manuscript presenteert twee methoden voor de snelle extractie van de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen van muizen, waardoor de stroomafwaartse analyse van residente cellen en perifeer afgeleide immuuncellen in het CZS-parenchym en hersenvliezen wordt vergemakkelijkt. Deze geoptimaliseerde protocollen richten zich op 1) het isoleren van eencellige suspensies voor downstream-analyse en 2) het voorbereiden van weefsel voor histologische verwerking. Het verkrijgen van eencellige suspensies uit de hersenen, ruggenmergweefsel en durale en arachnoïdalehersenvliezen 32 maakt de gelijktijdige analyse mogelijk van cellen die zich in zowel het parenchymale als het meningeale compartiment bevinden. Eencellige suspensies kunnen worden gebruikt in verschillende toepassingen, waaronder celkweektests om in vitro stimulatie 33 uit te voeren, enzyme-linked immunospot (ELISpot) 28,34,35, flowcytometrie 36,33 en single-cell 37 of bulk transcriptomics. Bovendien zorgt het geoptimaliseerde protocol voor ontkalking van hele hersenen en ruggenmerg met intacte schedels of wervelkolommen respectievelijk voor de zachte ontkalking van het omliggende bot, waardoor de hersenvliezen intact blijven en de weefselmorfologie behouden blijft. Deze methode maakt de selectieve identificatie van eiwitten of RNA mogelijk met behulp van immunohistochemie (IHC) of in situ hybridisatie (ISH) technieken binnen zowel de parenchymale als meningeale ruimten. De karakterisering van het fenotype, de activeringstoestand en de lokalisatie van residente cellen en perifeer afgeleide immuuncellen in het CZS kan informatie opleveren die essentieel is om te begrijpen hoe individuele celtypen in het CZS-compartiment bijdragen aan homeostase en ziektepathogenese.

Protocol

Al het dierenwerk maakt gebruik van protocollen die zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Geisel School of Medicine in Dartmouth. 1. Verwerking van hersen- en ruggenmergmonsters voor ontkalking Isoleren van hersen- en ruggenmergmonsters Euthanaseer de muis via CO 2-inhalatie. Zorg ervoor dat het CO 2-debiet 10%-30% van het kooivolume per minuut verplaatst. Til met ee…

Representative Results

Dit representatieve experiment was gericht op het kwantificeren van B- en T-cellen en het beschrijven van B- en T-cellokalisatie in de meningeale en parenchymale CZS-compartimenten in homeostatische omstandigheden en in een muizenprogressief MS-model (d.w.z. TMEV-IDD). TMEV-IDD werd geïnduceerd in 5 weken oude vrouwelijke SJL-muizen door intracraniële infectie met 5 x 106 plaquevormende eenheden (PFU) van TMEV BeAn zoals eerder beschreven29. De huidige stud…

Discussion

Methoden voor het evalueren van de cellulaire samenstelling in het CZS-compartiment tijdens homeostase en ziekte zijn essentieel voor het begrijpen van de fysiologische en pathologische toestanden van het CZS. Ondanks het feit dat ze dienen als een belangrijke barrière in het CZS en een breed scala aan immuuncellen huisvesten, worden de hersenvliezen vaak weggelaten uit de analyse omdat veel conventionele weefselextractiemethoden voor de hersenen en het ruggenmerg het verzamelen van deze membranen niet mogelijk maken. D…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken het personeel van het Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) in Dartmouth voor hun deskundige zorg voor de muizen die voor deze studies worden gebruikt. Het Bornstein Research Fund financierde dit onderzoek.

Materials

Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler’s Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019)
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

MeningesImmune CellsSingle Cell AnalysisHistological MethodsMicrogliaAstrocytesPericytesEndothelial CellsStromal CellsNeuronsBrainSpinal CordDecalcificationSkull CapVertebrae Column

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image