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Immunology and Infection

Isolierung von Geweben des Zentralnervensystems und zugehörigen Hirnhäuten für die nachgeschaltete Analyse von Immunzellen

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/61166
, , , , ,
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine,Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine,Dartmouth College

Summary

In dieser Arbeit werden zwei optimierte Protokolle für die Untersuchung von residenten und peripher abgeleiteten Immunzellen innerhalb des zentralen Nervensystems, einschließlich des Gehirns, des Rückenmarks und der Hirnhäute, vorgestellt. Jedes dieser Protokolle trägt dazu bei, die Funktion und Zusammensetzung der Zellen zu bestimmen, die diese Kompartimente unter stationären und entzündlichen Bedingungen besetzen.

Abstract

Das zentrale Nervensystem (ZNS) besteht aus Gehirn und Rückenmark und wird von den Hirnhäuten umhüllt, membranösen Schichten, die als Barriere zwischen der Peripherie und dem ZNS dienen. Das ZNS ist eine immunologisch spezialisierte Stelle, und unter stationären Bedingungen ist das Immunprivileg im ZNS-Parenchym am deutlichsten. Im Gegensatz dazu beherbergen die Hirnhäute eine Vielzahl von residenten Zellen, darunter angeborene und adaptive Immunzellen. Bei entzündlichen Erkrankungen, die durch ZNS-Verletzungen, Autoimmunitäten, Infektionen oder sogar Neurodegeneration ausgelöst werden, können peripher gewonnene Immunzellen in das Parenchym eindringen und sich in den Hirnhäuten einnisten. Es wird angenommen, dass diese Zellen während der Pathogenese der ZNS-Erkrankung sowohl nützliche als auch schädliche Wirkungen ausüben. Trotz dieses Wissens werden die Hirnhäute bei der Analyse des ZNS-Kompartiments oft übersehen, da herkömmliche ZNS-Gewebeextraktionsmethoden die Hirnhautschichten auslassen. Dieses Protokoll stellt zwei unterschiedliche Methoden für die schnelle Isolierung von murinem ZNS-Gewebe (d. h. Gehirn, Rückenmark und Hirnhäute) vor, die für die nachgeschaltete Analyse mittels Einzelzelltechniken, Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierungsmethoden geeignet sind. Die beschriebenen Methoden bieten eine umfassende Analyse von ZNS-Geweben, ideal für die Beurteilung des Phänotyps, der Funktion und der Lokalisation von Zellen, die das ZNS-Kompartiment unter homöostatischen Bedingungen und während der Krankheitspathogenese besetzen.

Introduction

Das Zentralnervensystem (ZNS) ist ein immunologisch spezialisiertes Zentrum. Das ZNS-Parenchym, mit Ausnahme des Liquorraums, der Hirnhäute und des Gefäßsystems, wird klassischerweise als immunprivilegierte Stelle angesehen 1,2,3,4,5 und ist unter homöostatischen Bedingungen relativ frei von Immunzellen 2,6,7. Im Gegensatz dazu sind die Hirnhäute, bestehend aus Dura-, Arachnoidal- und Pia-Schichten, entscheidende Bestandteile des ZNS-Kompartiments und nehmen aktiv an der homöostatischen Immunüberwachung und an Entzündungsprozessen während der Krankheitspathogenese teil 3,6,7,8. Unter stationären Bedingungen unterstützen die Hirnhäute zahlreiche Immunwächterzellen, darunter angeborene lymphatische Zellen (ILC), Makrophagen, dendritische Zellen (DC), Mastzellen, T-Zellen und in geringerem Maße B-Zellen 9,10,11.

Die Hirnhäute sind stark vaskularisierte Strukturen und enthalten Lymphgefäße, die eine lymphatische Verbindung zwischen dem ZNS und seiner Peripherie herstellen 8,12,13,14. Bei entzündlichen Erkrankungen, die durch ZNS-Verletzungen, Infektionen, Autoimmunität oder sogar Neurodegeneration hervorgerufen werden, infiltrieren peripher gewonnene Immunzellen das Parenchym und verändern die Immunlandschaft innerhalb der Hirnhäute. Nach der Zellinfiltration können die Hirnhäute eine funktionelle Nische für peripher gewonnene Immunzellen darstellen, die die Aggregation von Immunzellen, die lokale Aktivierung von Immunzellen und das langfristige Überleben im ZNS-Kompartiment fördern. Eine ausgeprägte meningeale Entzündung wird bei mehreren Erkrankungen des ZNS beobachtet, darunter Multiple Sklerose (MS)15,16,17,18,19, Schlaganfall 20,21, sterile Verletzung 22,23 (d. h. Rückenmarksverletzung und Schädel-Hirn-Trauma), Migräne 24 und mikrobielle Infektion 25,26.27,28,29. Daher ist die Charakterisierung von residenten Zellen und peripher abgeleiteten Immunzellen im meningealen Kompartiment essentiell für das Verständnis der Rolle dieser Zellen unter stationären Bedingungen und der Krankheitspathogenese.

Die Entnahme von Gehirn, Rückenmark und Hirnhäuten aus Schädel und Wirbelkörpern ist technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig. Derzeit gibt es keine Techniken für die schnelle Entnahme des Gehirns, bei dem alle drei Hirnhautschichten intakt sind. Während die Laminektomie eine hervorragende Morphologie des Rückenmarksgewebes ergibt und die Hirnhautschichten erhält, ist sie sowohl extrem zeitaufwändig als auch kompliziert30,31. Umgekehrt erleichtern konventionellere Extraktionsmethoden wie die Entfernung des Gehirns aus dem Schädel und die hydraulische Extrusion des Rückenmarks die schnelle Entnahme des ZNS-Gewebes, aber sowohl die Arachnoidal- als auch die Duralhirnhäute gehen bei diesen Techniken verloren30,31. Der Verzicht auf Dura- und Arachnoidalschichten bei der konventionellen Isolierung von Hirn- und Rückenmarksgewebe führt zu einer unvollständigen Analyse der Zellen innerhalb des ZNS-Kompartiments. Daher ist die Identifizierung neuer Techniken, die sich auf die schnelle Extraktion von ZNS-Gewebe mit intakten Hirnhäuten konzentrieren, entscheidend für die optimale Analyse des ZNS-Kompartiments.

In diesem Manuskript werden zwei Methoden zur schnellen Extraktion von Gehirn, Rückenmark und Hirnhäuten aus Mäusen vorgestellt, die die nachgeschaltete Analyse von residenten Zellen und peripher abgeleiteten Immunzellen im ZNS-Parenchym und in den Hirnhäuten erleichtern. Diese optimierten Protokolle konzentrieren sich auf 1) die Isolierung von Einzelzellsuspensionen für die nachgelagerte Analyse und 2) die Vorbereitung des Gewebes für die histologische Verarbeitung. Die Gewinnung von Einzelzellsuspensionen aus dem Gehirn, dem Rückenmarksgewebe und den Dural- und Arachnoidalmenhäuten32 ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Zellen, die sich sowohl im Parenchym- als auch im Meningealkompartiment befinden. Einzelzellsuspensionen können in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden, darunter Zellkulturassays zur Durchführung von In-vitro-Stimulation 33, Enzyme-Linked Immunospot (ELISpot)28,34,35, Durchflusszytometrie 36,33 und Einzelzell- 37 oder Bulk-Transkriptomik. Darüber hinaus ermöglicht das optimierte Protokoll zur Entkalkung ganzer Gehirne und Rückenmarks mit intakten Schädeln bzw. Wirbelsäulen eine schonende Entkalkung des umgebenden Knochens, wobei die Hirnhäute intakt bleiben und die Gewebemorphologie erhalten bleibt. Diese Methode ermöglicht die selektive Identifizierung von Proteinen oder RNA mittels Immunhistochemie (IHC) oder In-situ-Hybridisierung (ISH) sowohl im Parenchym- als auch im Meningealraum. Die Charakterisierung des Phänotyps, des Aktivierungszustands und der Lokalisation von residenten Zellen und peripher abgeleiteten Immunzellen innerhalb des ZNS kann Informationen liefern, die für das Verständnis unerlässlich sind, wie einzelne Zelltypen im ZNS-Kompartiment zur Homöostase und Krankheitspathogenese beitragen.

Protocol

Für die gesamte Tierarbeit werden Protokolle verwendet, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Geisel School of Medicine in Dartmouth überprüft und genehmigt wurden. 1. Aufbereitung von Hirn- und Rückenmarksproben zur Entkalkung Isolierung von Gehirn- und Rückenmarksproben Euthanasie der Maus durch CO2 – Inhalation. Stellen Sie sicher, dass die CO2 – Durchflussmenge 10 % bis 30 % des Käfigvolumens pro M…

Representative Results

Dieses repräsentative Experiment zielte darauf ab, B- und T-Zellen zu quantifizieren und die Lokalisation von B- und T-Zellen in den meningealen und parenchymalen ZNS-Kompartimenten unter homöostatischen Bedingungen sowie in einem murinen progredienten MS-Modell (d.h. TMEV-IDD) zu beschreiben. TMEV-IDD wurde in 5 Wochen alten weiblichen SJL-Mäusen durch intrakranielle Infektion mit 5 x 106 plaquebildenden Einheiten (PFU) von TMEV BeAn induziert, wie zuvor beschrieben29. <p class=…

Discussion

Methoden zur Bewertung der zellulären Zusammensetzung im ZNS-Kompartiment während der Homöostase und Krankheit sind essentiell für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Zustände des ZNS. Obwohl sie als wichtige Barriere im ZNS dienen und eine Vielzahl von Immunzellen beherbergen, werden die Hirnhäute oft von der Analyse ausgeschlossen, da viele herkömmliche Gewebeentnahmemethoden für Gehirn und Rückenmark die Entnahme dieser Membranen nicht zulassen. Diese Auslassung ist eine entscheidende Eins…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken den Mitarbeitern des Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) in Dartmouth für die fachkundige Betreuung der Mäuse, die für diese Studien verwendet wurden. Der Bornstein Forschungsfonds förderte diese Forschung.

Materials

Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath
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References

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DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).
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