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Immunology and Infection

Isolement des tissus du système nerveux central et des méninges associées pour l’analyse en aval des cellules immunitaires

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/61166
, , , , ,
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine,Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine,Dartmouth College

Summary

Cet article présente deux protocoles optimisés pour l’examen des cellules immunitaires résidentes et dérivées périphériques du système nerveux central, y compris le cerveau, la moelle épinière et les méninges. Chacun de ces protocoles permet de déterminer la fonction et la composition des cellules occupant ces compartiments dans des conditions d’équilibre et inflammatoires.

Abstract

Le système nerveux central (SNC) est composé du cerveau et de la moelle épinière et est enveloppé par les méninges, couches membraneuses servant de barrière entre la périphérie et le SNC. Le SNC est un site immunologiquement spécialisé, et dans des conditions d’état d’équilibre, le privilège immunitaire est le plus évident dans le parenchyme du SNC. En revanche, les méninges abritent un large éventail de cellules résidentes, y compris des cellules immunitaires innées et adaptatives. Au cours d’affections inflammatoires déclenchées par une lésion du SNC, une auto-immunité, une infection ou même une neurodégénérescence, des cellules immunitaires d’origine périphérique peuvent pénétrer dans le parenchyme et s’installer dans les méninges. On pense que ces cellules effectuent des actions à la fois bénéfiques et préjudiciables pendant la pathogenèse de la maladie du SNC. Malgré ces connaissances, les méninges sont souvent négligées lors de l’analyse du compartiment du SNC, car les méthodes conventionnelles d’extraction des tissus du SNC omettent les couches méningées. Ce protocole présente deux méthodes distinctes pour l’isolement rapide des tissus murins du SNC (c’est-à-dire le cerveau, la moelle épinière et les méninges) qui conviennent à l’analyse en aval via des techniques unicellulaires, l’immunohistochimie et les méthodes d’hybridation in situ. Les méthodes décrites fournissent une analyse complète des tissus du SNC, idéale pour évaluer le phénotype, la fonction et la localisation des cellules occupant le compartiment du SNC dans des conditions homéostatiques et pendant la pathogenèse de la maladie.

Introduction

Le système nerveux central (SNC) est un site immunologiquement spécialisé. Le parenchyme du SNC, à l’exclusion de l’espace du LCR, des méninges et du système vasculaire, est classiquement considéré comme un site privilégié par le système immunitaire 1,2,3,4,5 et est relativement dépourvu de cellules immunitaires dans des conditions homéostatiques 2,6,7. En revanche, les méninges, composées des couches de dure-mère, d’arachnoïde et de pia, sont des composants cruciaux du compartiment du SNC, participant activement à la surveillance immunitaire homéostatique et aux processus inflammatoires au cours de la pathogenèse de la maladie 3,6,7,8. Dans des conditions d’état d’équilibre, les méninges soutiennent de nombreuses cellules sentinelles immunitaires, notamment les cellules lymphoïdes innées (ILC), les macrophages, les cellules dendritiques (DC), les mastocytes, les lymphocytes T et, dans une moindre mesure, les lymphocytes B 9,10,11.

Les méninges sont des structures hautement vascularisées et contiennent des vaisseaux lymphatiques qui assurent une connexion lymphatique entre le SNC et sa périphérie 8,12,13,14. Dans les conditions inflammatoires induites par une lésion du SNC, des infections, une auto-immunité ou même une neurodégénérescence, les cellules immunitaires dérivées périphériques infiltrent le parenchyme et modifient le paysage immunitaire dans les méninges. Après l’infiltration cellulaire, les méninges peuvent représenter une niche fonctionnelle pour les cellules immunitaires dérivées périphériquement, favorisant l’agrégation des cellules immunitaires, l’activation locale des cellules immunitaires et la survie à long terme dans le compartiment du SNC. Une inflammation méningée importante est observée dans de multiples maladies affectant le SNC, y compris la sclérose en plaques (SEP)15,16,17,18,19, les accidents vasculaires cérébraux 20,21, les lésions stériles 22,23 (c.-à-d. lésions de la moelle épinière et les traumatismes crâniens), les migraines 24 et les infections microbiennes 25,26.27,28,29. Ainsi, la caractérisation des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le compartiment méningé est essentielle pour comprendre le rôle de ces cellules dans des conditions d’équilibre et de pathogenèse de la maladie.

L’extraction du cerveau, de la moelle épinière et des méninges du crâne et des corps vertébraux est techniquement difficile et prend du temps. Il n’existe actuellement aucune technique d’extraction rapide du cerveau avec les trois couches méningées intactes. Bien que la laminectomie donne une excellente morphologie du tissu de la moelle épinière et préserve les couches méningées, elle est à la fois extrêmement longue et compliquée30,31. À l’inverse, des méthodes d’extraction plus conventionnelles telles que l’ablation du cerveau du crâne et l’extrusion hydraulique de la moelle épinière facilitent l’extraction rapide du tissu du SNC, mais les méninges arachnoïdiennes et durales sont perdues avec ces techniques30,31. L’omission des couches de la dure-mère et de l’arachnoïde lors de l’isolement conventionnel des tissus du cerveau et de la moelle épinière entraîne une analyse incomplète des cellules du compartiment du SNC. Ainsi, l’identification de nouvelles techniques axées sur l’extraction rapide de tissus du SNC avec des méninges intactes est cruciale pour l’analyse optimale du compartiment du SNC.

Ce manuscrit présente deux méthodes d’extraction rapide du cerveau, de la moelle épinière et des méninges chez la souris, facilitant l’analyse en aval des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le parenchyme et les méninges du SNC. Ces protocoles optimisés se concentrent sur 1) l’isolement de suspensions unicellulaires pour l’analyse en aval et 2) la préparation des tissus pour le traitement histologique. L’obtention de suspensions unicellulaires du cerveau, du tissu de la moelle épinière et des méninges durales et arachnoïdiennes32 permet l’analyse simultanée des cellules résidant à la fois dans les compartiments parenchymateux et méningé. Les suspensions unicellulaires peuvent être utilisées dans différentes applications, y compris les tests de culture cellulaire pour effectuer une stimulation in vitro 33, l’immunospot enzymatique (ELISpot)28,34,35, la cytométrie en flux36,33 et la transcriptomique unicellulaire 37 ou en vrac. De plus, le protocole optimisé pour la décalcification de cerveaux entiers et de moelles épinières avec des crânes ou des colonnes vertébrales intacts, respectivement, permet une décalcification douce de l’os environnant, laissant les méninges intactes et préservant la morphologie des tissus. Cette méthode permet l’identification sélective de protéines ou d’ARN à l’aide de techniques d’immunohistochimie (IHC) ou d’hybridation in situ (ISH) dans les espaces parenchymateux et méningés. La caractérisation du phénotype, de l’état d’activation et de la localisation des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le SNC peut fournir des informations essentielles pour comprendre comment les types de cellules individuelles dans le compartiment du SNC contribuent à l’homéostasie et à la pathogenèse de la maladie.

Protocol

Tous les travaux sur les animaux utilisent des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Geisel School of Medicine de Dartmouth. 1. Traitement d’échantillons de cerveau et de moelle épinière pour la décalcification Isolement d’échantillons de cerveau et de moelle épinière Euthanasier la souris par inhalation de CO2 . Assurez-vous que le débit deCO2 …

Representative Results

Cette expérience représentative visait à quantifier les lymphocytes B et T et à décrire la localisation des lymphocytes B et T dans les compartiments méningés et parenchymateux du SNC dans des conditions homéostatiques ainsi que dans un modèle murin de SEP progressive (c’est-à-dire TMEV-IDD). Le TMEV-IDD a été induit chez des souris SJL femelles âgées de 5 semaines par une infection intracrânienne avec 5 x 106 unités formant la plaque (PFU) de TMEV BeAn, comme décrit précédemment<sup class…

Discussion

Les méthodes d’évaluation de la composition cellulaire dans le compartiment du SNC au cours de l’homéostasie et de la maladie sont essentielles pour comprendre les états physiologiques et pathologiques du SNC. Cependant, bien qu’elles constituent une barrière importante dans le SNC et qu’elles abritent un large éventail de cellules immunitaires, les méninges sont souvent omises de l’analyse car de nombreuses méthodes conventionnelles d’extraction de tissus pour le cerveau et la moelle épinière ne pe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le personnel du Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) de Dartmouth pour les soins spécialisés qu’ils ont prodigués aux souris utilisées pour ces études. Cette recherche a été financée par le Fonds de recherche de Bornstein.

Materials

Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath
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DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).
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