JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Выделение тканей центральной нервной системы и связанных с ними мозговых оболочек для последующего анализа иммунных клеток

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/61166
, , , , ,
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine,Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine,Dartmouth College

Summary

В данной работе представлены два оптимизированных протокола исследования резидентных и периферических иммунных клеток в центральной нервной системе, включая головной и спинной мозг и мозговые оболочки. Каждый из этих протоколов помогает установить функцию и состав клеток, занимающих эти компартменты, в равновесном состоянии и воспалительных условиях.

Abstract

Центральная нервная система (ЦНС) состоит из головного и спинного мозга и окружена мозговыми оболочками, мембранными слоями, служащими барьером между периферией и ЦНС. ЦНС является иммунологически специализированным участком, и в стационарных условиях иммунная привилегия наиболее выражена в паренхиме ЦНС. Напротив, мозговые оболочки содержат разнообразный набор резидентных клеток, включая врожденные и адаптивные иммунные клетки. Во время воспалительных состояний, вызванных повреждением ЦНС, аутоиммунными заболеваниями, инфекцией или даже нейродегенерацией, периферические иммунные клетки могут проникать в паренхиму и поселиться в мозговых оболочках. Считается, что эти клетки выполняют как полезные, так и вредные действия в патогенезе ЦНС. Несмотря на эти знания, мозговые оболочки часто упускаются из виду при анализе компартмента ЦНС, потому что традиционные методы экстракции тканей ЦНС опускают менингеальные слои. В этом протоколе представлены два различных метода быстрого выделения тканей ЦНС мышей (т.е. головного мозга, спинного мозга и мозговых оболочек), которые подходят для последующего анализа с помощью одноклеточных методов, иммуногистохимии и методов гибридизации in situ. Описанные методы обеспечивают комплексный анализ тканей ЦНС, идеально подходящий для оценки фенотипа, функции и локализации клеток, занимающих компартмент ЦНС, в гомеостатических условиях и при патогенезе заболевания.

Introduction

Центральная нервная система (ЦНС) является иммунологически специализированным участком. Паренхима ЦНС, исключая ликворное пространство, мозговые оболочки и сосудистую сеть, классически рассматривается как иммунопривилегированный участок 1,2,3,4,5 и относительно лишена иммунных клеток в гомеостатических условиях 2,6,7. Напротив, мозговые оболочки, состоящие из слоев твердой мозговой оболочки, арахноидального слоя и слоев мия, являются важнейшими компонентами компартмента ЦНС, активно участвуя в гомеостатическом иммунном надзоре и воспалительных процессах при патогенезе заболевания 3,6,7,8. В равновесном состоянии мозговые оболочки поддерживают многочисленные иммунные клетки, включая врожденные лимфоидные клетки (ILC), макрофаги, дендритные клетки (DC), тучные клетки, Т-клетки и, в меньшей степени, В-клетки 9,10,11.

Мозговые оболочки представляют собой сильно васкуляризированные структуры и содержат лимфатические сосуды, обеспечивающие лимфатическую связь между ЦНС и ее периферией 8,12,13,14. При воспалительных состояниях, вызванных повреждением ЦНС, инфекциями, аутоиммунными заболеваниями или даже нейродегенерацией, периферические иммунные клетки проникают в паренхиму и изменяют иммунный ландшафт в мозговых оболочках. После клеточной инфильтрации мозговые оболочки могут представлять собой функциональную нишу для периферических иммунных клеток, способствуя агрегации иммунных клеток, локальной активации иммунных клеток и длительному выживанию в компартменте ЦНС. Выраженное воспаление менингеальных оболочек наблюдается при множественных заболеваниях, поражающих ЦНС, включая рассеянный склероз (РС)15,16,17,18,19, инсульт 20,21, стерильные повреждения 22,23 (т.е. повреждение спинного мозга и черепно-мозговые травмы), мигрени 24 и микробную инфекцию 25,26,27,28,29. Таким образом, характеристика резидентных клеток и периферических иммунных клеток в менингеальном компартменте имеет важное значение для понимания роли этих клеток в стационарных условиях и патогенеза заболевания.

Извлечение головного, спинного мозга и мозговых оболочек из черепной коробки и тел позвонков является технически сложным и трудоемким процессом. В настоящее время не существует методов быстрого извлечения мозга с неповрежденными всеми тремя менингеальными слоями. Несмотря на то, что ламинэктомия дает превосходную морфологию тканей спинного мозга и сохраняет менингеальные слои, она чрезвычайно трудоемка и сложна30,31. И наоборот, более традиционные методы экстракции, такие как извлечение головного мозга из черепной коробки и гидравлическая экструзия спинного мозга, способствуют быстрому извлечению ткани ЦНС, но при использовании этих методов утрачиваются как паутинные, так и твердые мозговые оболочки30,31. Опущение твердой мозговой оболочки и паутинных слоев при обычном выделении тканей головного и спинного мозга приводит к неполному анализу клеток в компартменте ЦНС. Таким образом, идентификация новых методик, ориентированных на быстрое извлечение тканей ЦНС с интактными мозговыми оболочками, имеет решающее значение для оптимального анализа компартмента ЦНС.

В данной статье представлены два метода быстрого извлечения головного, спинного мозга и мозговых оболочек у мышей, облегчающие последующий анализ резидентных клеток и периферических иммунных клеток в паренхиме и мозговых оболочках ЦНС. Эти оптимизированные протоколы сосредоточены на 1) выделении одноклеточных суспензий для последующего анализа и 2) подготовке ткани к гистологической обработке. Получение одноклеточных суспензий из тканей головного мозга, спинного мозга, твердых мозговых и паутинных мозгов32 позволяет проводить одновременный анализ клеток, находящихся как в паренхиматозном, так и в менингеальном компартментах. Одноклеточные суспензии могут быть использованы в различных областях, включая анализ клеточных культур для стимуляции in vitro 33, иммуноферментное пятно (ELISpot)28,34,35, проточную цитометрию 36,33 и одноклеточную 37 или объемную транскриптомику. Кроме того, оптимизированный протокол декальцинации всего головного и спинного мозга с интактными черепами или позвоночными столбами, соответственно, позволяет мягко декальцинировать окружающую кость, оставляя мозговые оболочки нетронутыми и сохраняя морфологию тканей. Этот метод позволяет проводить селективную идентификацию белков или РНК с помощью методов иммуногистохимии (ИГХ) или гибридизации in situ (ISH) как в паренхимозном, так и в менингеальном пространствах. Характеристика фенотипа, состояния активации и локализации резидентных клеток и периферических иммунных клеток в ЦНС может предоставить информацию, необходимую для понимания того, как отдельные типы клеток в компартменте ЦНС вносят вклад в гомеостаз и патогенез заболевания.

Protocol

Во всех работах с животными используются протоколы, рассмотренные и одобренные Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинской школе Гейзеля в Дартмуте. 1. Обработка образцов головного и спинного мозга для декальцинации Выделение образцов…

Representative Results

Этот репрезентативный эксперимент был направлен на количественную оценку В- и Т-клеток и описание локализации В- и Т-клеток в менингеальных и паренхиматозных компартментах ЦНС в гомеостатических условиях, а также в мышиной модели прогрессирующего рассеянного склероза (т.е. TMEV-IDD). TMEV-IDD ?…

Discussion

Методы оценки клеточного состава в компартменте ЦНС в период гомеостаза и заболевания имеют важное значение для понимания физиологических и патологических состояний ЦНС. Однако, несмотря на то, что они служат важным барьером в ЦНС и содержат разнообразный набор иммунных клеток, мозго?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят сотрудников Центра сравнительной медицины и исследований (CCMR) в Дартмуте за их экспертную помощь мышам, использованным для этих исследований. Исследовательский фонд Борнштейна финансировал это исследование.

Materials

Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler’s Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019)
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

MeningesImmune CellsSingle Cell AnalysisHistological MethodsMicrogliaAstrocytesPericytesEndothelial CellsStromal CellsNeuronsBrainSpinal CordDecalcificationSkull CapVertebrae Column

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image