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Immunology and Infection

Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/61166
, , , , ,
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine,Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine,Dartmouth College

Summary

Este artículo presenta dos protocolos optimizados para examinar las células inmunitarias residentes y derivadas periféricas dentro del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal y las meninges. Cada uno de estos protocolos ayuda a determinar la función y composición de las células que ocupan estos compartimentos en estado estacionario y en condiciones inflamatorias.

Abstract

El sistema nervioso central (SNC) está compuesto por el cerebro y la médula espinal y está envuelto por las meninges, capas membranosas que sirven como barrera entre la periferia y el SNC. El SNC es un sitio inmunológicamente especializado y, en condiciones de estado estacionario, el privilegio inmunitario es más evidente en el parénquima del SNC. Por el contrario, las meninges albergan una amplia gama de células residentes, incluidas las células inmunitarias innatas y adaptativas. Durante las afecciones inflamatorias desencadenadas por una lesión del SNC, la autoinmunidad, la infección o incluso la neurodegeneración, las células inmunitarias de origen periférico pueden entrar en el parénquima y residir dentro de las meninges. Se cree que estas células realizan acciones beneficiosas y perjudiciales durante la patogénesis de la enfermedad del SNC. A pesar de este conocimiento, las meninges a menudo se pasan por alto cuando se analiza el compartimento del SNC, porque los métodos convencionales de extracción de tejido del SNC omiten las capas meníngeas. Este protocolo presenta dos métodos distintos para el aislamiento rápido de tejidos murinos del SNC (es decir, cerebro, médula espinal y meninges) que son adecuados para el análisis posterior mediante técnicas unicelulares, inmunohistoquímica y métodos de hibridación in situ. Los métodos descritos proporcionan un análisis exhaustivo de los tejidos del SNC, ideal para evaluar el fenotipo, la función y la localización de las células que ocupan el compartimento del SNC en condiciones homeostáticas y durante la patogénesis de la enfermedad.

Introduction

El sistema nervioso central (SNC) es un sitio inmunológicamente especializado. El parénquima del SNC, excluyendo el espacio LCR, las meninges y la vasculatura, es considerado clásicamente como un sitio inmunoprivilegiado 1,2,3,4,5 y está relativamente desprovisto de células inmunitarias durante las condiciones homeostáticas 2,6,7. Por el contrario, las meninges, compuestas por las capas duramadre, aracnoidea y pia, son componentes cruciales del compartimento del SNC, participando activamente en la vigilancia inmunitaria homeostática y en los procesos inflamatorios durante la patogénesis de la enfermedad 3,6,7,8. Durante las condiciones de estado estacionario, las meninges albergan numerosas células centinela inmunitarias, incluidas las células linfoides innatas (ILC), los macrófagos, las células dendríticas (DC), los mastocitos, las células T y, en menor medida, las células B 9,10,11.

Las meninges son estructuras altamente vascularizadas y contienen vasos linfáticos que proporcionan una conexión linfática entre el SNC y su periferia 8,12,13,14. En las afecciones inflamatorias inducidas por lesiones del SNC, infecciones, autoinmunidad o incluso neurodegeneración, las células inmunitarias de origen periférico se infiltran en el parénquima y alteran el paisaje inmunitario dentro de las meninges. Después de la infiltración celular, las meninges pueden representar un nicho funcional para las células inmunitarias derivadas periféricamente, promoviendo la agregación de células inmunitarias, la activación local de las células inmunitarias y la supervivencia a largo plazo en el compartimento del SNC. La inflamación meníngea prominente se observa en múltiples enfermedades que afectan al SNC, incluyendo la esclerosis múltiple (EM)15,16,17,18,19, el accidente cerebrovascular 20,21, la lesión estéril 22,23 (es decir, la lesión de la médula espinal y la lesión cerebral traumática), las migrañas 24 y la infección microbiana 25,26,27,28,29. Por lo tanto, la caracterización de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente en el compartimento meníngeo es esencial para comprender el papel de estas células durante las condiciones de estado estacionario y la patogénesis de la enfermedad.

La extracción del cerebro, la médula espinal y las meninges del cráneo y los cuerpos vertebrales es técnicamente difícil y requiere mucho tiempo. Actualmente no existen técnicas disponibles para la extracción rápida del cerebro con las tres capas meníngeas intactas. Si bien la laminectomía produce una excelente morfología del tejido de la médula espinal y preserva las capas meníngeas, requiere mucho tiempo y es extremadamente complicada30,31. Por el contrario, los métodos de extracción más convencionales, como la extirpación del cerebro del cráneo y la extrusión hidráulica de la médula espinal, facilitan la extracción rápida del tejido del SNC, pero con estas técnicas se pierden tanto las meninges aracnoideas como las durales30,31. La omisión de las capas duramadre y aracnoidea durante el aislamiento convencional de los tejidos del cerebro y la médula espinal da lugar a un análisis incompleto de las células dentro del compartimento del SNC. Por lo tanto, la identificación de nuevas técnicas enfocadas a la extracción rápida de tejidos del SNC con meninges intactas es crucial para el análisis óptimo del compartimento del SNC.

Este manuscrito presenta dos métodos para la extracción rápida del cerebro, la médula espinal y las meninges de ratones, lo que facilita el análisis posterior de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente en el parénquima y las meninges del SNC. Estos protocolos optimizados se centran en 1) aislar suspensiones unicelulares para el análisis posterior y 2) preparar el tejido para el procesamiento histológico. La obtención de suspensiones unicelulares del cerebro, del tejido de la médula espinal y de las meninges durales y aracnoideas32 permite el análisis simultáneo de las células que residen en los compartimentos parenquimatoso y meníngeo. Las suspensiones unicelulares se pueden utilizar en diferentes aplicaciones, incluidos los ensayos de cultivo celular para realizar estimulación in vitro 33, inmunopunto ligado a enzimas (ELISpot)28,34,35, citometría de flujo36,33 y transcriptómica de una sola célula 37 o a granel. Además, el protocolo optimizado para la descalcificación de cerebros enteros y médula espinal con cráneos o columnas vertebrales intactos, respectivamente, permite la descalcificación suave del hueso circundante, dejando las meninges intactas y preservando la morfología del tejido. Este método permite la identificación selectiva de proteínas o ARN mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) o hibridación in situ (ISH) tanto en el espacio parenquimatoso como en el meníngeo. La caracterización del fenotipo, el estado de activación y la localización de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente dentro del SNC puede proporcionar información esencial para comprender cómo los tipos de células individuales en el compartimento del SNC contribuyen a la homeostasis y la patogénesis de la enfermedad.

Protocol

Todo el trabajo con animales utiliza protocolos revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Geisel en Dartmouth. 1. Procesamiento de muestras de cerebro y médula espinal para la descalcificación Aislamiento de muestras de cerebro y médula espinal Sacrificar al ratón mediante inhalación de CO2 . Asegúrese de que el caudal deCO2 desplace entre el 10 % y el 30 % d…

Representative Results

Este experimento representativo tuvo como objetivo cuantificar las células B y T y describir la localización de las células B y T en los compartimentos meníngeo y parenquimatoso del SNC en condiciones homeostáticas, así como en un modelo de EM progresiva murina (es decir, TMEV-IDD). La TMEV-IDD fue inducida en ratones hembra SJL de 5 semanas de edad mediante infección intracraneal con 5 x 106 unidades formadoras de placa (UFP) de TMEV BeAn como se describió anteriormente29. …

Discussion

Los métodos para evaluar la composición celular en el compartimento del SNC durante la homeostasis y la enfermedad son esenciales para comprender los estados fisiológicos y patológicos del SNC. Sin embargo, a pesar de servir como una barrera importante en el SNC y albergar una amplia gama de células inmunitarias, las meninges a menudo se omiten del análisis porque muchos métodos convencionales de extracción de tejidos para el cerebro y la médula espinal no permiten la recolección de estas membranas. Esta omisi?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen al personal del Centro de Medicina e Investigación Comparativa (CCMR) de Dartmouth por su atención experta a los ratones utilizados para estos estudios. El Fondo de Investigación Bornstein financió esta investigación.

Materials

Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath
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DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).
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