İskemiye neden olan doku hasarının kantitatif değerlendirilmesi için bir yöntem le birlikte, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen kardiyomiyositler kullanılarak iskemik kalp hastalığı nın bir modelini saklı atıyoruz. Bu model ilaç tarama ve iskemik kalp hastalığı üzerinde daha fazla araştırma için yararlı bir platform sağlayabilir.
İskemik kalp hastalığı dünya çapında önemli bir ölüm nedenidir. Bu nedenle, genellikle kemirgenler gibi küçük hayvan modelleri ile, araştırma muazzam miktarda konu olmuştur. Ancak, insan kalbinin fizyolojisi önemli ölçüde kemirgen kalp farklıdır, kalp hastalığı çalışma için klinik olarak ilgili modeller için ihtiyaç altını çizerek. Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPS-CM) farklı kardiyomiyositler kullanarak iskemik kalp hastalığını modellemek ve iskemik kardiyomiyositlerin hasar ını ve fonksiyonel bozukluğunu ölçmek için bir protokol saklıyız. Glikoz ve serum olmadan %2 oksijene maruz kalmak, çekirdeğin propidium iyodürile boyanması ile endike olan yaralı hücrelerin yüzdesini artırır ve hücresel canlılığı azaltır. Bu koşullar aynı zamanda mikroskobik video görüntülerinin yer değiştirme vektör alan analizi ile doğrulanan hiPS-CM’lerin kontryağışlılığını azaltır. Bu protokol ayrıca bireysel hastalardan hiPS hücrelerinin kullanımını kolaylaştırarak kişiselleştirilmiş ilaç taraması için uygun bir yöntem sağlayabilir. Bu nedenle, iskemik kalp hastalığı bu model, insan kökenli iPS-CMs dayalı, ilaç tarama ve iskemik kalp hastalığı üzerinde daha fazla araştırma için yararlı bir platform sağlayabilir.
İskemik kalp hastalığı (İhD) dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olarak kabul edilmektedir ve 2016 yılında dokuz milyondan fazla ölümden sorumlu olduğu tahmin edilmektedir1. Kardiyovasküler hastalık prevalansı artmaya devam etmektedir ve küreselleşme gelişmekte olan ülkelerde kalp hastalığı risk faktörlerinin yaygınlığına katkıda bulunmuş gibi görünmektedir. Bu nedenle, İhD çalışma giderek daha acil hale geliyor2.
Kardiyovasküler hastalıkların deneysel modelleri, hastalığın mekanizmaları, tanının doğruluğu ve yeni tedavilerin geliştirilmesi açısından kritik öneme yöneliktir. Birçok deneysel model birçok laboratuvar tarafından önerilmiştir. Önemli avantajlara sahip bir model seçmek son derece önemlidir; fizibilite, tekrarlanabilirlik ve insan hastalığına benzerlik kardiyovasküler hastalık modellerinin seçiminde önemli faktörlerdir3. Spesifik kardiyomiyopati ile ilişkili mutasyonlar taşıyan insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSCs) hayvan modelleri için umut verici bir alternatiftir4. Birçok strateji iPSCs kullanarak kardiyomiyosit indükleme için tarif edilmiş olmasına rağmen5,6,7,8,9, Burada biz hiPSCs farklı kardiyomiyositler kullanarak bir İhD modeli üretmek için basit bir yöntem sağlamak, hangi kardiyomiyosit kullanarak kardiyomiyosit zahmetli seçimi uygulanmaz. Bu yöntemde kardiyomiyositler fonksiyonel olarak spontan kontraksiyon analiz edilerek seçilir.
HiPSC kullanan kardiyomiyositin indüksiyonu hayvan kurban ını ve teknik olarak zor ameliyatları önler. İhD hayvan modelleri kurulması zorlu cerrahi teknikler10gerektirir. Kalp hızı ve kemirgenlerin fizyolojisinden etki potansiyelleri gibi insan kalp hastalığının çeşitli patofizyolojik yönlerini mükemmel bir şekilde simüle etmek neredeyse imkansızdır. Hayvan modellerinin kullanılmasının ahlakı ve etiği ile birleştiğinde, hayvan modelleri dışında yeni deneysel modellerin geliştirilmesi zorunludur. İnsan iPS hücrelerinden farklı kardiyomiyositler insan kalbinin fizyolojik durumunu daha iyi taklit eder. Bu protokolde hiPS hücrelerinden (hiPS-CM) elde edilen kardiyomiyositler kullanılarak Bir İhD modeli oluşturduk. Bizim modelimizde, oksijen ve glikoz yoksunluğu kontraktil kuvvet ve hiPS-CM’lerin canlılık azalmaya yol açar. Yöntemimiz Modeli İhD için yeni bir yaklaşım sağlar ve bu hastalığın çalışması için yeni bir platform göstermektedir.
Araştırmacılar genellikle İhD deneyleri yapmak için laboratuvar küçük hayvan modelleri kullanın. Burada, bu tür deneylericra etmek için insan İhD’nin bir hücre kültürü modelini geliştirdik.
Bu protokolün bir kullanıcı karşılaşabileceği temel sorun farklılaştırılmış kardiyomiyosit lerin düşük oranda karşılaşAbileceği. Başarılı farklılaşma oranını artırmak için büyük bir özenle birkaç adım atılmalıdır: (a) hücre bölünmesi enzimleri reaktifi ilave edildikten sonra hücreler kolayca ayırmak, çünkü pipetleme nazik olmak, (b) Y-27632’yi eklemek, ayrışırken iPS hücrelerinin hayatta kalma oranını arttırır ve (c) farklılaşmanın başlangıcındaki orta değişikliklerin zamanlaması, farklılaşmada yer alan genlerin kontrollü bir şekilde ifade edilmesini sağlamak için tam olarak 48 saat arayla olmalıdır.
Kültür plakasının yüzeyinin kaplanmasında kullanılan hücre dışı matriks proteinleri ile ilgili olarak, bu protokolde kullandığımız laminin dışındaki diğer malzemeler de kullanılabilir. Örneğin, Matrigel14,15, ve jelatin16,17 hiPSCs besleyici ücretsiz bakım kültürü için kullanılır. Haraguchi ve ark göre, Matrigel üzerinde tohumlu hiPSCs başarıyla kardiyak hücre levha18olarak ayırt edildi.
HiPSC’lerden elde edilen kardiyomiyositler kullanılarak hastalık modellemesi için kültür modelleri ile ilgili daha önceki çalışmalar vardır. İskemi-reperfüzyon hasarının modelleştirilmesi ile ilgili olarak, hiperkalemi, asidoz ve laktat birikimi gibi hücresel çevrenin manipülasyonları19. Diğer yöntemler arasında oksijen difüzyonu engellemek için hücre peletleme20 ve siyanür kullanarak metabolik inhibisyonu21. Mevcut protokolde, hücre hasarı nispeten basit bir yöntem, yani oksijen ve besin 24 saat yoksunluk ile elde edildi. Ancak, iskemik kalp hastalığının doğru patofizyolojik süreçlerini göz önünde bulundurmaya özen gerekir, çünkü in vivo hastalığı ile mevcut protokolün hastalık modeli arasında üç boyutlu hücresel çevre ve kan varlığı veya yokluğu gibi gerçekten farklılıklar vardır.
Kardiyomiyosit fonksiyonunun değerlendirilmesinin teknolojik yönü ile ilgili olarak, Toepfer ve ark. hiPS-CMs22sarcomere daralma ve gevşeme belirlemek için bir MatLab tabanlı algoritma bildirdi. Smith ve ark. gelişmiş nanotopografik desenli çok elektrot dizileri 23 kullanarak, hiPS-CMs türetilen heyecanlı hücrelerin yüksek iş lenme elektrofizyolojik analizi gelişmiş bir yöntem bildirdi23,24. Protokolümüzün avantajı, imageJ yazılımı ve 96 kuyulu plakalar gibi sadece geleneksel yazılım ve sarf malzemeleri gerektirmesidir.
Kalpteki oksijen seviyesine göre kalbe ulaşan damarlarda oksijen basıncının 40 mmHg25olduğu düşünülmektedir. McDougal ve ark.’ya göre hipoksi altındaki ekstrasellüler oksijen basıncının <12.8 mmHg26olduğu tahmin edilmektedir. 27.Rounds yöntemi uygulanarak, mevcut protokolle tedavi edilen 37 °C’de hipoksik durum altında (tuzluluk: 35)) kültür ortamındaki oksijen basıncı yukarıdaki tahminden daha yüksek olan 14,9 mmHg olarak hesaplanır. İlginçtir, Al-Ani ve ark kültür orta oksijen basıncı bir gradyan olduğunu bildirdi, ve oksijen basıncı hücre tipi etkilenir, tohumlama yoğunluğu, ve orta hacim28. Tipik olarak, hücrelerin yaşadığı kültür plakasının altındaki oksijen konsantrasyonu en düşüktür. Bu nedenle, kültür ortamı derinlik etkisi daha da hiPS-CMs yakın etkili oksijen basıncı azaltacaktır. HiPS-CM’lere hipoksik durum la yeterli hasar vermek için ortamın derinliğine ve hücre yoğunluğuna dikkat edilmelidir.
İnsan kardiyak miyositlerinin fizyolojik koşullarına çok yakın olan hiPS-CM modelimiz insan İhD’sini avantajlı bir şekilde taklit etmektedir. Hayvan modeline dayalı yaklaşımlar etik, teknik ve akademik konuları içerir. Özellikle, in vivo modelleri tekrarlanabilir veri elde etmek için mikrocerrahi gelişmiş bir teknik gerektirir: örneğin, kemirgenler sol koroner arterin anterior inen dalı oklüzyon3. Burada açıklanan hiPS-CM modeli bu kritik engelleri aşar ve kardiyovasküler hastalıklar için yararlı, alakalı ve tekrarlanabilir bir platform sağlar.
Ancak, bazı sınırlamalar belirtilmelidir. iPS’ye bağlı kardiyomiyositler ile normal kardiyomiyositler arasındaki bariz fark T-tübüllerinyokluğu29’durve çalışmamızda lökositlerin neden olduğu doku hasarı ve kompleman sisteminin aktivasyonu gibi mizahi faktörleri içermedik. Ayrıca bu modelde diferansiye kardiyomiyosit oranı (20.7 ± %9.6, Ek Şekil 3)artırılmalıdır. Halloin ve ark. tarafından son yayın belirteçleri30tarafından herhangi bir seçim gerek kalmadan kimyasal WNT yol modülatörleri tarafından hiPS-CM saflık >95% hiPS-CM saflık neden ölçeklenebilir, kimyasal olarak tanımlanmış bir yöntem açıklar. Bununla birlikte, insan İhD modelimiz nispeten basit ve klinik olarak uygulanabilirdir (örn. hasta kaynaklı iPS hücreleri kullanılarak ilaç taraması). Modelimiz aynı zamanda IHD’lerin altında yatan mekanizmaları daha da açıklamak için benzersiz bir platformdur.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma JSPS KAKENHI, Ortak Uluslararası AraştırmaYı Destekleme Fonu (Ortak Uluslararası Araştırmayı Teşvik Etmek), 17KK0168 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar minnetle Merkezi Araştırma Laboratuvarı, Okayama Üniversitesi Tıp Fakültesi FACS yardımı için kabul.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |